[發明專利]細菌(柔膜細菌)污染的改良檢測

有效

• 申請號: 201080033520.2
• 申請日: 2010-07-29
• 公開（公告）號: CN102471804A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發明（設計）人: C·比克納
• 申請（專利權）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;郭文潔

本發明提供了通過抑制非特異性擴增產物改良的基于PCR的靶序列擴增。改良涉及使用被最佳化以在第一種生物的基因組DNA的背景中擴增污染物的核酸的引物對。當對懷疑包含污染物的來自第二種生物的DNA實施相同的基于PCR的擴增反應時，當第一種生物的基因組DNA的量存在于擴增反應中時，污染物的檢測靈敏度和特異性增強。

發明背景

支原體屬(Mycoplasma)是屬于缺乏細胞壁的柔膜體綱的細菌屬。沒有細胞壁，支原體屬細菌不受靶向原核細胞壁合成的許多常見抗生素影響，所述抗生素例如青霉素或其他β-內酰胺抗生素。存在超過100種公認的支原體屬物種，柔膜體綱(Mollicutes)中的幾個屬之一。柔膜細菌是人、其他動物(包括昆蟲)和植物的寄生蟲或共生體；支原體屬通過定義被限定于脊椎動物宿主。膽固醇是支原體屬以及柔膜細菌(mollicutes)的某些其他屬的物種生長所需的。它們的最佳生長溫度通常是其宿主的溫度，如果是溫血的(warmbodied)(例如在人中37℃)，或環境溫度，如果宿主不能調節其自身內部溫度。16S核糖體RNA序列的分析以及基因含量強烈暗示柔膜細菌包括支原體與系統樹的乳桿菌屬(Lactobacillus)或梭菌屬(Clostridium)分支(在嚴格意義上厚壁菌門(Firmicutes))緊密相關。

支原體屬物種通常在研究實驗室中作為細胞培養中的污染物發現。支原體細胞培養污染可以由于來自個體的污染或污染的細胞培養基成分而發生。支原體細胞物理上是很小的-小于1μm-并且它們因此難以用常規顯微鏡檢測。支原體可以誘導細胞改變，包括染色體畸變、代謝和細胞生長中的改變。嚴重支原體感染具有破壞細胞系的潛力。

支原體還涉及作為許多疾病中的病原體。肺炎支原體(Mycoplasma?pneumoniae)是社區獲得性肺炎的主要成因劑。

螺原體屬(Spiroplasma)物種通過分子和血清學研究近期已與傳播性海綿狀腦病(TSEs)關聯(Bastian，F.O.，J?Neuropathol?Exp?Neurol?64(2005)833-838)。然而，螺原體屬物種與TSEs的關系仍是有爭議的，例如考慮到檢測受綿羊瘋癢病感染的倉鼠腦中螺原體的任何足跡的rRNA種類的參與者不知情研究的失敗(Alexeeva，I.，等人，J?Clin?Microbiol?44(2006)91-97)。然而，在考慮中的TSEs包括綿羊中的綿羊瘋癢病、鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)和人中的克雅氏病。顱內接種到綿羊和山羊內的從受綿羊瘋癢病侵襲的綿羊腦和受CWD侵襲的鹿腦中分離的螺旋體屬物種誘導非常類似這些動物中的天然TSE的海綿狀腦病。這些數據明確顯示螺原體與TSE相關。

顯示螺原體屬細菌在含胚卵中生長且可以在此類培養系統中傳代(Bastian，F.O.，等人，Journal?of?Medical?Microbiology?56(2007)1235-1242)。

含胚卵在疫苗生產中起主要作用。例如，針對流行性感冒的人疫苗已可用幾乎60年，并且直到最近，幾乎完全由在9到11天齡的含胚雞卵的尿囊腔中生長的病毒進行制備。因此，螺原體的致病性潛力使得柔膜體綱病原體的檢測成為用于確保由含胚卵制備的任何產物的安全的首要重要的工具。

此外，在生物藥物生產、細胞療法和組織工程過程中支原體污染的可能性尤其是主要問題。由全世界的藥典和藥物管理機構要求的常規檢測法使用在培養基上的生長，以鑒定污染生物。這些基于培養的技術要求長時間以達到結果。此外，某些支原體屬物種的培養可能是不可能或不可靠的。因此，需要改良且特別是更快速和可靠的微生物測定。

Eldering，J.A.，等人，Biologicals?32(2004)183-193公開了用于中國倉鼠卵巢細胞培養的支原體測試的PCR法。測試的原理是首先分離來自細胞培養(細胞和上清液)的基因組DNA，并且其次使用對于支原體屬物種的16S-rRNA基因中的區域特異的引物和分離的DNA作為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)。在陽性結果的情況下，形成且檢測到對應于靶向區域的擴增產物。當未形成擴增產物時，獲得陰性結果。