[發明專利]細菌(柔膜細菌)污染的改良檢測

有效

• 申請號: 201080033520.2
• 申請日: 2010-07-29
• 公開（公告）號: CN102471804A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發明（設計）人: C·比克納
• 申請（專利權）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;郭文潔

1.一種用于測定具有生物學材料的樣品中細菌污染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括步驟

(a)處理所述樣品且純化來自所述經處理的樣品的核酸，隨后為

(b)形成用于基于PCR的擴增反應的組合物(反應混合物)，所述組合物包括

-根據SEQ?ID?NO：1的第一種引物、

-根據SEQ?ID?NO：2的第二種引物，和

-步驟(a)的所述純化核酸或其測量的部分作為模板；隨后為

(c)用步驟(b)的所述組合物進行聚合酶鏈式反應(PCR)；隨后為

(d)檢測擴增的靶序列的存在或不存在，其中所述擴增的靶序列的存在指示所述樣品中所述細菌污染物的存在，并且所述擴增的靶序列的不存在指示所述樣品中所述細菌污染物的不存在；

所述改良的特征在于相對于所述樣品的體積，將來自CHO細胞的預定量的DNA加入(i)所述樣品、或(ii)步驟(a)的所述經處理的樣品、或(iii)在步驟(a)中獲得的所述純化核酸、或(iv)步驟(b)的所述組合物中，由此所加入的來自CHO細胞的DNA減少步驟(d)中的非特異性擴增。

2.權利要求1的方法，其特征在于每ml液體樣品的DNA預定濃度在10μg/1ml樣品-250μg/1ml樣品的范圍中。

3.根據權利要求1和2中任一項的方法，其特征在于所述液體樣品選自具有培養的細胞的細胞培養基、無細胞的培養上清液和羊膜液。

4.根據權利要求3的方法，其特征在于所述液體樣品是羊膜液。

5.根據權利要求4的方法，其特征在于所述羊膜液來自含胚卵。

6.根據權利要求1-5中任一項的方法，其特征在于所述細菌污染物是選自無膽甾原體屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、微球菌屬、支原體屬、螺原體屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的屬。

7.根據權利要求6的方法，其特征在于所述細菌污染物是選自豬鼻支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、發酵支原體、口腔支原體和梨形支原體的支原體屬物種，或所述細菌污染物是萊氏無膽甾原體，或所述細菌污染物是非凡螺原體。

8.一種組合物，其包含來自含胚卵的羊膜液和來自CHO細胞的DNA。

9.根據任何權利要求8的組合物，其進一步包含選自離液劑和蛋白酶的裂解試劑。

10.一種組合物，其包含(i)來自樣品的純化核酸，所述樣品選自羊膜液、真核細胞的懸液和來自真核細胞的懸液的上清液，和(ii)不含原核DNA的來自CHO細胞的DNA。

11.根據權利要求10的組合物，其進一步包含根據SEQ?ID?NO：1的第一種引物、根據SEQ?ID?NO：2的第二種引物、核苷酸三磷酸和耐熱的DNA聚合酶。

12.根據權利要求11的組合物，其進一步包含嵌入染料。

13.一種試劑盒，其在分開的容器中包含(i)裂解試劑，(ii)以預定濃度的來自CHO細胞的純化DNA，所述DNA不含原核DNA，和(iii)根據SEQ?ID?NO：1的第一種引物和根據SEQ?ID?NO：2的第二種引物。

14.根據權利要求10-12中任一項的組合物用于擴增原核污染物的DNA的用途，所述原核污染物的DNA來自從樣品中分離的DNA，所述樣品選自羊膜液、真核細胞的懸液和來自真核細胞的懸液的上清液。

15.一種用于進行聚合酶鏈式反應(PCR)的改良方法，

其中通過DNA聚合酶催化的一對寡核苷酸引物延伸形成具有范圍為約100bp-約1500bp大小的特異性擴增產物，所述引物各自與一種或多種原核生物的16S-rRNA的基因組互補體中包含的靶序列雜交，

其中所述寡核苷酸引物對能夠在PCR中形成來自第一種模板的特異性擴增產物，所述PCR在預定條件(R)下在具有預定組合物的反應混合物(Q)中進行，并且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，

并且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物對在相同條件(R)下在反應混合物(Q)中不形成來自第二種模板的擴增產物，其中在所述第二種模板中，不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA，

所述改良方法包括以下步驟：

(a)提供所述寡核苷酸引物對；

(b)提供所述第一種真核生物的基因組DNA；

(c)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA；

(d)在所述反應混合物(Q)中混合(a)的所述引物對、(c)的所述第三種模板、和(b)的所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測量的量，和在條件(R)下進行PCR；

其中非特異性PCR擴增產物的形成被抑制。