[發明專利]核酸擴增方法

無效

• 申請號: 201080030802.7
• 申請日: 2010-06-02
• 公開（公告）號: CN102459626A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發明（設計）人: 亞歷山大·艾倫·莫利;邁克爾·朱利安·布里斯科
• 申請（專利權）人: 莫諾夸特有限公司;弗林德斯大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 顧晉偉;盧蓓

本發明一般性地涉及擴增目的核酸區域的方法，更特別地，本發明涉及通過巢式單管PCR(nested?single?tube?PCR)來擴增目的核酸區域的方法。設計本發明方法以提供下述手段，即選擇性失活外引物的功能并在整個反應過程中保持擴增效率。在單管巢式PCR的背景下開發實現用外引物有效擴增而后用內引物有效擴增的手段可用于一些應用，其包括但不限于診斷和/或監測特征為特定基因序列的疾病狀況，以及表征或分析特定目的基因區域。本發明方法不僅用于簡單的檢測，還能進行定量。

發明背景

本說明書對任何現有出版物(或源自其的信息)或任何已知事實的引用不是并且不應被認為是承認或認可或以任何形式暗示現有出版物(或源自其的信息)或已知事實構成本說明書相關領域的公知常識。

本說明書中作者所引用的出版物詳細目錄在本說明書結尾處按字母順序匯總。

聚合酶鏈式反應(PCR)是用于擴增DNA鏈的特定區域的技術。DNA鏈可以是單個基因、基因的僅僅一部分或非編碼序列。大部分PCR方法通常擴增多達10k堿基對(kilo?base?pair，kb)的DNA片段，但一些技術允許擴增大小達40kb的片段(Cheng等，1994，Proc?Natl?Acad?Sci.91：5695-5699)。

目前實施的PCR需要幾種基本組分(Sambrook和Russel，2001，Molecular?Cloning：A?Laboratory?Manual，第三版)。這些組分是：

●DNA模板，其包含待擴增DNA片段的區域；

●引物，其與待擴增DNA區域5’和3’端的DNA區域互補；

●DNA聚合酶(例如Taq聚合酶或最適溫度在70℃左右的其他熱穩定DNA聚合酶)，其用于合成待擴增區域的DNA拷貝；和

●三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)，DNA聚合酶利用其構建新DNA。

PCR在包含通常為15-100μl反應體積的小反應管(體積0.2-0.5ml)中進行，所述小反應管被插入熱循環儀中。該儀器加熱和冷卻其中的反應管至反應每個步驟所需的精確溫度。大部分熱循環儀包含加熱蓋以防止在反應管帽內部上的冷凝。或者，可在反應混合物上放置一層油以防止蒸發。

因此，PCR是允許較長DNA分子中的DNA序列以指數擴增的方法。該反應包括多個擴增循環，并且在每個循環中每個分子反應的模板是樣品中初始DNA鏈或在先前循環中合成的DNA鏈。每個PCR循環包括以下步驟

-加熱變性以將DNA雙鏈體的兩條鏈分離

-將上游和下游引物與它們的互補序列雜交

-DNA聚合酶將引物延伸以產生模板序列的互補拷貝

通常，選擇PCR試劑和條件以使變性、雜交和延伸以接近最大效率進行，從而每個循環中期望序列的量以接近兩倍的倍數增加。在PCR結束時產生大量的擴增，例如30個循環的PCR會使初始模板擴增倍數接近2³⁰(1,000,000,000)。這種程度的擴增便于檢測和分析擴增產物。

在多個擴增循環后，可以終止PCR并以多種方式分析產物，最常見地是通過凝膠電泳分析。當PCR進行至限定的終點時，擴增產物的量通常不與放入的靶DNA量密切相關，并且這類PCR只是檢測特定DNA存在與否的定性工具和/或為了提供進一步分析所用的足量靶DNA。

為了測量信使RNA(mRNA)，該方法首先使用逆轉錄酶將mRNA轉化成互補DNA(cDNA)，然后通過PCR擴增cDNA并用瓊脂糖凝膠電泳分析。類似地，逆轉錄而后進行終點PCR基本上是定性技術。

為了提供定量能力，開發了實時PCR。該方法遵循PCR的一般模式，只是在每個循環中對所擴增的DNA定量。定量的兩種常見方法是使用嵌入雙鏈DNA的熒光染料以及使用其熒光在PCR步驟之一中發生變化的經修飾DNA寡核苷酸引物或探針。實時聚合酶鏈式反應經常與逆轉錄酶聚合酶鏈式反應相組合來對低豐度的信使RNA(mRNA)進行定量，使研究者對特定時間或特定細胞或組織類型中的相對基因表達進行定量。

(i)使用結合雙鏈DNA之染料的實時PCR

DNA結合染料(如Sybr?Green)在PCR反應中結合所有雙鏈(ds)DNA，導致染料熒光增強。因此PCR中DNA產物的增加導致在每個循環所測量的熒光強度增加，從而允許對DNA濃度進行定量。

(ii)熒光報告序列法