[發明專利]核酸擴增方法

無效

• 申請號: 201080030802.7
• 申請日: 2010-06-02
• 公開（公告）號: CN102459626A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發明（設計）人: 亞歷山大·艾倫·莫利;邁克爾·朱利安·布里斯科
• 申請（專利權）人: 莫諾夸特有限公司;弗林德斯大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 顧晉偉;盧蓓

1.一種擴增目的核酸區域的方法，所述方法包括：

(i)將核酸樣品與以下項相接觸：

(a)針對所述目的區域的第一正向引物和針對所述目的區域的第一反向引物；和

(b)針對所述目的區域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的T_m低于所述第一正向引物的T_m；和

針對所述目的區域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的T_m低于所述第一反向引物的T_m；和

(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的T_m低于所述第一引物；而且

其中(b)和(c)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；

(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的核酸樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和

(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的核酸樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。

2.權利要求1的方法，所述方法包括：

(i)將DNA樣品與以下項相接觸：

(a)針對所述目的區域的第一正向引物和針對所述目的區域的第一反向引物；和

(b)針對所述目的區域的第二正向引物，其中所述第二引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的T_m低于所述第一正向引物的T_m；和

針對所述目的區域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的T_m低于所述第一反向引物的T_m；和

(c)針對所述目的區域的第三正向引物，其中所述第三正向引物針對位于所述第二正向引物所針對序列3’的DNA序列，并且所述第三正向引物的T_m低于所述第二正向引物的T_m；和

針對所述目的區域的第三反向引物，其中所述第三反向引物針對位于所述第二反向引物所針對序列5’的DNA序列，并且所述第三反向引物的T_m值低于所述第二反向引物的T_m值；和

(d)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的T_m低于所述第一引物；以及針對所述第二引物的一種或多種反義寡核苷酸，每種所述反義寡核苷酸的T_m低于所述第二引物；

其中(b)、(c)和(d)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；

(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交，但不使所述第二引物以及第三引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和

(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及針對所述第一引物的所述反義寡核苷酸雜交，但不使所述第三引物以及針對所述第二引物的所述反義寡核苷酸雜交；

(iv)在下述退火溫度下擴增步驟(iii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第三引物以及針對所述第二引物的所述反義寡核苷酸雜交。

3.權利要求1或2的方法，其中所述核酸是DNA。

4.權利要求1或2或3的方法，其中所述反義寡核苷酸之一與所述引物的3’端雜交并且包含5’核酸標簽序列，所述標簽的互補核苷酸序列相對于所述引物雜交位點的5’端相鄰的DNA區域之核苷酸序列是錯配的。

5.權利要求1或2或3的方法，其中一種或多種所述反義寡核苷酸包含不能進行正常延伸的3’端。