[發(fā)明專(zhuān)利]用于抑制單或多靶基因的多順?lè)醋觭hRNA表達(dá)盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080028461.X
• 申請(qǐng)日: 2010-06-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102575248A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛大寓
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 薛大寓
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11;C12N15/63
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11204
• 代理人: 王達(dá)佐;洪欣

發(fā)明背景

1.發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于抑制單或多靶基因的多順?lè)醋觭hRNA，并且更具體地，涉及多順?lè)醋觭hRNA表達(dá)盒，包含所述多順?lè)醋觭hRNA表達(dá)盒的表達(dá)載體，用所述多順?lè)醋觭hRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，所述表達(dá)載體和轉(zhuǎn)運(yùn)體的復(fù)合物，抑制各種靶基因的方法，以及包含所述表達(dá)載體的用于抑制靶基因的組合物。

2.相關(guān)領(lǐng)域描述

RNA干擾(在下文中，被稱(chēng)為RNAi)是指通過(guò)細(xì)胞內(nèi)引入雙鏈RNA(dsRNA)選擇性誘導(dǎo)靶mRNA降解以及靶基因沉默的現(xiàn)象，所述雙鏈RNA(dsRNA)由與靶基因的mRNA同源的正義RNA和具有與所述正義RNA互補(bǔ)的序列的反義RNA組成。通過(guò)RNAi的選擇性靶基因沉默代替通過(guò)同源重組的常規(guī)低效的基因阻斷作為簡(jiǎn)單的基因敲低(knock-down)或基因治療，越來(lái)越受關(guān)注和廣泛利用。化學(xué)合成的小干擾RNA(在下文中，被稱(chēng)為“siRNA”)和啟動(dòng)子-依賴(lài)型表達(dá)的小發(fā)夾RNA(在下文中，被稱(chēng)為“shRNA”)在體外和體內(nèi)顯示有效力的基因沉默活性。然而，與化學(xué)合成的siRNA相比，啟動(dòng)子-依賴(lài)型shRNA提供幾個(gè)優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，包括在細(xì)胞和整個(gè)有機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)，以及細(xì)胞類(lèi)型特異性表達(dá)。可以將shRNA分成兩種不同的類(lèi)型：第一代和第二代shRNA(圖1)。第一代shRNA簡(jiǎn)單地模擬化學(xué)合成的siRNA，而第二代shRNA源自在各種有機(jī)體內(nèi)表達(dá)的天然microRNA，并且顯示更強(qiáng)的功能性。第二代shRNA的結(jié)構(gòu)特征(圖1)還允許更靈活地選擇啟動(dòng)子和靶shRNA序列。

在siRNA的情況下，作用于不同位點(diǎn)的混合siRNA比作用于單一位點(diǎn)的單個(gè)siRNA被更頻繁地用于沉默單靶基因，因?yàn)樽饔糜诓煌稽c(diǎn)的混合siRNA顯示更強(qiáng)的沉默活性，并且各種siRNA可以通過(guò)化學(xué)合成容易地制備。還將作用于不同位點(diǎn)的混合siRNA用于沉默多個(gè)不同的基因，從而適當(dāng)?shù)爻聊鞣N基因。相反地，啟動(dòng)子-依賴(lài)型shRNA主要用作單順?lè)醋樱率箖H沉默一個(gè)單靶基因。因此，為利用啟動(dòng)子-依賴(lài)型shRNA沉默多靶基因，遞送對(duì)應(yīng)于靶基因數(shù)量的多個(gè)shRNA表達(dá)構(gòu)建體是必要的。因而，若利用僅僅一個(gè)單一shRNA表達(dá)構(gòu)建體可以沉默多靶基因，該方法將顯著最小化由使用多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體引起的憂(yōu)慮，包括難以表達(dá)等摩爾量的shRNA，相同的啟動(dòng)子重復(fù)序列之間重組頻率高，以及shRNA表達(dá)構(gòu)建體在治療手段如基因治療的開(kāi)發(fā)中的質(zhì)量控制。此外，該方法將允許簡(jiǎn)便且快速地分析多靶基因的功能。

為了通過(guò)利用一個(gè)shRNA表達(dá)構(gòu)建體沉默單或多靶基因的目的，本發(fā)明人注意到第二代shRNA，尤其是源自mir-30的shRNA，因?yàn)樵搒hRNA已被更好地表征結(jié)構(gòu)和核酸酶剪切位點(diǎn)。本發(fā)明人假設(shè)mir-30microRNA的結(jié)構(gòu)特征，重要的是與microRNA的先導(dǎo)序列相關(guān)的結(jié)構(gòu)靈活性，可能允許形成表達(dá)含有多shRNA的多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄本的盒。本發(fā)明人做出努力以證明該假設(shè)，由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明簡(jiǎn)述

本發(fā)明的目的是提供多順?lè)醋觭hRNA表達(dá)盒，其包含啟動(dòng)子和可操作地連接到所述啟動(dòng)子的兩個(gè)或更多個(gè)編碼對(duì)靶基因特異的shRNA(小發(fā)夾RNA)的多聚核苷酸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含所述表達(dá)盒的表達(dá)載體，用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，以及所述載體和轉(zhuǎn)運(yùn)體的復(fù)合物。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供利用所述表達(dá)盒抑制各種目的靶基因的方法。

本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供包含所述表達(dá)載體的用于抑制靶基因的組合物。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示siRNA、第一代shRNA和第二代shRNA的結(jié)構(gòu)比較，其中比較了化學(xué)合成的siRNA和兩種不同的shRNA，并且核苷酸鏈各自標(biāo)示于框內(nèi)，而顏色相反的框指示靶基因的正義和反義序列，并且在第二代shRNA中，圈出的是用于相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本正義鏈的第一個(gè)核苷酸，并且核酸酶剪切位點(diǎn)由Drosha和Dicer的直線(xiàn)標(biāo)示。

圖2顯示單獨(dú)的shRNA表達(dá)構(gòu)建體的功能測(cè)試，其中：

A.顯示源自mir-30的模板shRNA序列，除核苷酸鏈外，該序列標(biāo)示于框內(nèi)，而顏色相反的框通常用作制備所有shRNA表達(dá)構(gòu)建體的模板；

B.顯示設(shè)計(jì)用于沉默人XIAP、Akt和Bcl-2的shRNA序列，其中核苷酸鏈各自標(biāo)示于框內(nèi)，而顏色相反的框指示靶基因的正義和反義序列；

C.顯示將與同源shRNA相應(yīng)的插入DNA序列克隆至穿梭載體中用于生產(chǎn)腺病毒；