[發(fā)明專利]制造異源多聚體分子的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080026552.X
• 申請日: 2010-04-27
• 公開（公告）號: CN102459346B
• 公開（公告）日: 2016-10-26
• 發(fā)明（設計）人: 奧斯丁·L·格尼;阿龍·肯·薩拓
• 申請（專利權）人: 昂考梅德藥品有限公司
• 主分類號: C07K16/46
• 分類號: C07K16/46;C07K16/28;C07K16/22;C07K16/18;C12N15/13;C12N1/21;C12N1/19;C12N5/10;C12P21/02;C12P21/08;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 丁香蘭;龐東成

技術領域

本發(fā)明提供制造諸如雙特異性抗體等異源多聚體分子的方法，和包含所述分子的組合物。所述方法包括在兩條多肽間的界面處相接觸的氨基酸中引入取代。上述取代包括使組成異源多聚體分子的多肽之間的靜電相互作用和/或疏水/親水相互作用發(fā)生改變的氨基酸變化。在上述取代所產生的多聚體分子中，同源多聚體分子是不利的，而優(yōu)選形成異源多聚體分子。

背景技術

單克隆抗體的特點在于其特異性地結合特定抗原的能力，該能力使其能夠在體內結合其靶標但不結合非抗原部位。一旦與靶標結合，治療性單克隆抗體就能夠遞送毒性有效載量，充當受體的激動劑或拮抗劑，或充當配體的中和劑。還可以對單克隆抗體進行修飾，從而使其在各物種中具有更好的免疫耐受性。一種此類修飾是人源化，其需要將結構區(qū)域中的氨基酸置換為存在于人體中的氨基酸。隨后可對人源化抗體進行進一步修飾。一種此類修飾是使人源化抗體帶有額外的細胞毒性機制，其可以是放射性同位素、細菌毒素、炎性細胞因子、化療劑或前藥。

越來越多的有功效的癌癥治療劑得到了批準，其或者是嵌合抗體(利妥昔單抗(Rituximab))或人源化IgG1(赫賽汀(Herceptin)和Campath-1H)，或者是帶有化療劑的綴合物(Mylotarg)或帶有放射性同位素的綴合物(Zevalin和Bexxar)。盡管存在這些進展，用于癌癥治療的單克隆抗體的功效仍然有限，因此進一步的改進還有巨大的潛力。一類有望對癌癥治療具有更強效力的抗體衍生物是雙特異性抗體。

在其結合臂中具有雙重特異性的抗體通常在自然界中不存在，因此這種抗體是通過重組DNA或細胞融合技術來開發(fā)的。經設計，多數(shù)雙特異性抗體可募集有效抵抗病原靶細胞的具有細胞毒性的免疫系統(tǒng)效應細胞。在超過15年的深入研究后，已開發(fā)出多種不同類型的雙特異性抗體，但僅有少數(shù)進入了臨床試驗階段。

在最早的雙特異性抗體當中，有經設計用來使針對癌靶細胞的T細胞重新定向的構建體。當細胞毒性T淋巴細胞(CLT)附著在腫瘤細胞上并同時被與T細胞受體(TCR)-CD3復合體相互作用的雙特異性抗體的一個臂觸發(fā)時，靶細胞會被殺死。CTL據(jù)認為是免疫系統(tǒng)的最強力的殺傷細胞，其因缺乏Fcγ受體而不能被單克隆抗體使用。

另一類雙特異性抗體是同時結合腫瘤細胞和激活性Fcγ受體(例如，單核細胞上的CD64/FcγRI)的那些雙特異性抗體。該類型的雙特異性抗體與Fcγ受體的結合能夠引發(fā)效應細胞的活化，并且不受到同時結合正常IgG的競爭。

一種產生雙特異性抗體的方法稱為“knobs-into-holes(球入洞)”方案(參見例如WO2006/028936)。在此技術中，使構成人IgG中CH3結構域的界面的選定氨基酸突變，從而減少了Ig重鏈的錯配。在CH3結構域內兩條重鏈的直接相互作用的位置上，將具有小側鏈的氨基酸(hole(洞))引入一條重鏈的序列中，并將具有大側鏈的氨基酸(knob(球))引入另一條的序列中。結果是，據(jù)已描述，knob和hole之間的蛋白相互作用導致了經轉染的哺乳動物宿主細胞形成了多達90％的正確的雙特異性人IgG。

本發(fā)明通過用疏水性更高的氨基酸殘基置換參與親水相互作用的氨基酸殘基和/或通過用另一氨基酸置換參與電荷相互作用的氨基酸來使在兩條多肽間的界面處相互作用的選定氨基酸突變，從而提供了優(yōu)選形成異源多聚體分子的方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供制備包含兩條多肽的異源多聚體多肽的方法，所述兩條多肽都含有人免疫球蛋白CH3結構域，所述方法包括將所述兩條多肽中的一條的CH3結構域內的至少一個氨基酸取代為另一氨基酸，從而促進異源多聚體的形成，所述至少一個氨基酸位于與選自由人IgG2的236位、245位、249位、278位、286位和288位組成的組的位置對應的位置。在一個實施方式中，本發(fā)明提供制備包含兩條多肽的異源多聚體多肽的方法，所述兩條多肽都含有人免疫球蛋白CH3結構域，所述方法包括將所述兩條多肽中的每一條的CH3結構域中的至少一個帶電荷氨基酸殘基取代為帶相反電荷的氨基酸。在另一個實施方式中，取代后的氨基酸對在異源多聚體多肽中形成離子對。