[發明專利]復雜核酸的擴增

有效

• 申請號: 201080025156.5
• 申請日: 2010-06-03
• 公開（公告）號: CN102459632B
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: C·科菲哈格;E·菲希
• 申請（專利權）人: 恰根有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司31100
• 代理人: 楊帆

技術領域

本發明涉及生物學和化學領域，特別涉及分子生物學領域。本發明具體涉及復雜核酸如全基因組、轉錄物組和亞硫酸氫鹽組(bisulfitome)的擴增。

發明背景

復雜模板核酸的擴增在許多分子生物學應用中起著重要的作用。因此對于一些應用而言，需要分別擴增全基因組(全基因組擴增，WGA)、全轉錄物組(全轉錄物組擴增，WTA)或全亞硫酸氫鹽組(全亞硫酸氫鹽組擴增，WBA)。

各種參數對于此類復雜核酸的成功擴增必不可少：

合適的反應條件為必然要求。這包括例如具有適合pH值和適合單價鹽和二價鹽組成的合適緩沖液。然而，其還包括至少一種合適的聚合酶，并且合適的擴增反應溫度是成功擴增的必要因素。

決定性參數為所使用的復雜模板核酸的量。如果復雜模板核酸的量過小，則其將無法滿足全基因組的要求。例如，6pg人基因組DNA的量大約相當于單倍體人類基因組。如果用于一個WGA反應的量小于6pg，則在WGA中不能對人類基因組進行完全擴增，因為其不能代表所有的片段。同時，小于100pg的量也可能過小，因為在此量下來自隨機效應的特定片段不足或過多。

復雜模板核酸擴增的第三個決定性參數分別為樣品或其中包含的復雜模板核酸的質量。術語“質量”可包括不同的方面：

含有復雜模板核酸待擴增樣品可具有抑制因子，所述抑制因子以競爭或變構方式抑制所用聚合酶或可破壞聚合酶的活性構象。在下文中，這類物質將被稱為反式抑制因子。此類反式抑制因子包括例如重金屬離子(例如Ni離子、Fe離子、Mn離子、Zn離子等)、帶負電的聚合物(例如肝素、硫酸葡聚糖等)或常常用于核酸制備的蛋白變性物質(例如SDS、酚等)。

然而，樣品還可包含與核酸結合從而(例如)通過防止核酸變性或通過防止核酸被聚合酶識別來抑制擴增的物質。在下文中，這類物質將被稱為順式抑制因子。此類順式抑制因子可為蛋白質(例如組蛋白等)、帶正電的物質(例如帶正電的聚合物、帶正電的氨基酸等)。

核酸可表現出各種缺陷，使得在缺陷位點不再可能通過聚合酶進行延伸反應。這些缺陷位點可為例如單鏈或雙鏈切口或脫堿基位點存在修飾堿基的位點(例如在DNA中修飾成氧鳥嘌呤或尿嘧啶)。

目前，在復雜模板核酸的擴增反應開始時，僅可在不足的程度上檢測這些定量和定性特性。其中存在的待擴增復雜核酸的質量和數量通常并不明確。因此，在存在少量復雜模板核酸的情況下，不能通過OD260測量來進行濃度測量。如果DNA的量足以進行凝膠電泳，則僅可通過凝膠電泳測定DNA損傷。目前尚不能測定其它損傷，諸如脫堿基DNA片段。

例如經由定量PCR對復雜模板核酸的這些定性參數的控制不能令人滿意，因為如果模板核酸的平均尺寸＞1kb，則定量PCR僅對部分降解DNA的尺寸差異的檢測效果較差。然而，此類尺寸差異對于復雜核酸的擴增而言至關重要。

發明內容

因此，本發明涉及一種對樣品中的一種或多種待擴增的復雜模板核酸進行定量和定性分析的方法，其包括以下步驟：

提供反應混合物，其包含

-待擴增的復雜模板核酸；

-指定量的至少一種對照核酸，其中所述對照核酸與模板核酸具有小于50％的序列相同性，并且其中所述對照核酸具有至少一種已知的序列片段；

-用于模板核酸擴增的引物；

-用于對照核酸擴增的引物；

-適于核酸擴增的酶和試劑；

對模板核酸和對照核酸進行共同擴增，其中所述共同擴增等溫進行，其中所述共同擴增包括鏈置換反應，并且其中模板和對照核酸基本上在所述擴增中完全擴增；

完成所述共同擴增后，對擴增的對照核酸進行定量。

因此，在本發明中，將一種或多種外源對照核酸添加到反應混合物中以擴增一種或多種復雜模板核酸。添加適于復雜模板核酸和/或對照核酸擴增的引物和試劑以及酶之后，進行復雜模板和對照核酸的共同擴增。因此，對照核酸與復雜模板核酸平行擴增。對照核酸的擴增程度取決于復雜模板核酸的存在、數量和質量。由于對照核酸和模板核酸競爭擴增反應源(如引物、dNTP、聚合酶)，因此對照為競爭性對照。完成共同擴增后，對擴增的對照核酸進行定量。以此方式測定的數量使得可分別對復雜模板核酸的起始量或質量得出結論。擴增后少量的對照核酸與足夠數量和質量的所用復雜模板核酸相關。因此，由較大量的擴增對照核酸可推斷所用復雜核酸的數量或質量不足。