[發明專利]用于測定神經毒素多肽的量及其催化活性和蛋白酶解活性的手段和方法

有效

• 申請號: 201080018544.0
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN102414564A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: M·普法伊爾;J·弗里德里希
• 申請（專利權）人: 莫茨制藥有限及兩合公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 黃革生;林柏楠

技術領域

本發明屬于用于確保多肽生產和質量控制的工具領域。具體來說，本發明涉及在含有已加工好的神經毒素多肽和部分加工的或未加工的神經毒素多肽的溶液中確定加工好的(活性)神經毒素多肽的量的方法。本發明還涉及用于測定所述量的裝置以及適用于實施本發明方法的試劑盒。

背景技術

肉毒梭菌(Clostridium?botulinum)和破傷風梭菌(Clostridium?tetani)產生強效的神經毒素，即分別為肉毒桿菌毒素(BoNTs)和破傷風毒素(TeNT)。這些梭菌神經毒素(CNTs)特異地和神經元細胞結合并破壞神經遞質的釋放。每種毒素合成為無活性的、未加工的約150kDa的單鏈蛋白質。翻譯后的加工包括二硫鍵的形成、以及由細菌蛋白酶進行的有限的蛋白酶解(切割)。活性神經毒素由通過二硫鍵相連的兩條鏈組成，一條約50kDa的N-端輕鏈和一條約100kDa的重鏈。CNTs在結構上和功能上由3個結構域組成，即具有催化功能的輕鏈、包含移位結構域(translocation)(N-端的半部分)和受體結合結構域(C-端的半部分)的重鏈，見Krieglstein1990，Eur?J?Biochem?188，39；Krieglstein?1991，Eur?J?Biochem?202，41；Krieglstein?1994，J?Protein?Chem?13，49。肉毒桿菌毒素被合成為包含150kDa神經毒素蛋白和相關非毒性蛋白的分子復合物。復合物的大小根據梭菌的菌株和獨特的神經毒素血清型而不同，在300kDa、大于500kDa和900kDa之間變化。這些復合物中的非毒性蛋白具有穩定神經毒素、保護其不被降解的作用，見Silberstein?2004，Pain?Practice?4，S19-S26。

肉毒梭菌分泌7種抗原性上獨特的肉毒桿菌毒素(BoNT)血清型，稱為血清型A至G。所有這些血清型與破傷風梭菌分泌的相關破傷風神經毒素(TeNT)一起是Zn2+內切蛋白酶，它們通過切割SNARE蛋白來阻斷突觸的胞吐，見Couesnon，2006，Microbiology，152，759。CNTs導致見于肉毒中毒和破傷風的弛緩性肌肉癱瘓，見Fischer?2007，PNAS?104，10447。

盡管具有毒性效應，肉毒桿菌毒素復合物已被用作許多疾病的治療劑。肉毒桿菌毒素血清型A于1989年在美國被批準人用以治療斜視、瞼痙攣以及其它疾病。它在商業上以肉毒桿菌毒素A蛋白制劑獲取，例如，在商業名BOTOX(Allergan公司)或商業名DYSPORT(Ipsen公司)下。一種改進的、無復合的肉毒桿菌毒素A制劑可以以商業名XEOMIN(Merz?Pharmaceuticals?GmbH)商業獲得。作為治療用途，該制劑被直接注射到需要治療的肌肉中。在生理pH值時，該毒素從蛋白質復合物中被釋放出來并產生期望的藥理學效應。肉毒桿菌毒素的效應只是短暫的，這正是為什么可能需要反復施用肉毒桿菌毒素以維持治療效果的原因。

梭菌神經毒素減弱隨意肌的強度，是對斜視、局灶性肌張力障礙，包括頸部張力障礙、和良性特發性瞼痙攣有效的療法。它們還已經被證實可以緩解半面痙攣和局灶性強直，此外，在例如胃腸道病癥、多汗癥以及美容抗皺修復等其它廣泛的適應癥中有效，見Jost?2007，Drugs?67，669。

在梭菌神經毒素的生產過程中，活性神經毒素多肽的定性和定量確定及其質量控制非常重要。目前可獲得的神經毒素制劑除了包含所需要的活性(已加工好的或成熟的)神經毒素之外，還包含未經蛋白酶解加工的前體和/或部分加工的神經毒素多肽。未經蛋白酶解加工的前體或部分加工的神經毒素多肽和成熟的(活性的、已加工好的)神經毒素多肽在序列上只有少數幾個氨基酸的差異。因此，很難根據它們的化學和物理特性將其定量地區分開來。另一方面，在這類制劑中，未經蛋白酶解加工的前體和/或部分加工的神經毒素多肽在總蛋白中所占的部分可能仍然顯著。該部分取決于用于生產的生物系統，并是發酵過程中的生物合成和反應條件的結果。因此，在神經毒素制劑中所需要的成熟、具有生物活性的神經毒素多肽的含量是預先規定的，并且目前非常難以確定。

迫切需要用于成熟(活性)神經毒素多肽的可靠定性和定量檢測系統的工具和方法，這些工具和方法目前還不可獲得。

因此，本發明的技術問題可以看做提供滿足上述需要的工具和方法。該技術問題通過在權利要求和下文中描述的實施方案得到了解決。

發明內容