[發明專利]納米顆粒介導的序列特異性核酸酶的投遞

有效

• 申請號: 201080015582.0
• 申請日: 2010-04-07
• 公開（公告）號: CN102369287A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: J.薩繆爾;J.佩托里諾;N.薩姆博朱;S.韋伯;K.姚
• 申請（專利權）人: 陶氏益農公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 封新琴

對相關申請的交叉引用

本申請要求2009年4月7日提交的美國臨時申請61/167,389的權益。

發明背景

可以利用納米顆粒的獨特性質來將DNA投遞到細胞中。在所調查的納米顆粒(例如鎢、鋁、鎳等)中，金納米顆粒(GNP)趨向為投遞DNA的卓越候選物。低細胞毒性和容易用有生物學意義的多種配體官能化使金納米顆粒成為轉化的優先選擇。金納米顆粒的大小范圍可以為1.2nm-600nm。通常使用的GNP合成對20-400nm的顆粒生成帶負電荷(例如檸檬酸鹽包被)的表面，而更小的1-10nm范圍的GNP是帶正電荷的。質粒DNA(其具有足以部分解開其堿基的柔性)可以暴露于金納米顆粒。在檸檬酸鹽官能化的GNP的情況中，質粒DNA能部分解開。DNA主鏈上的負電荷足夠遠，從而使得堿基與金納米顆粒間的范德華引力引起質粒DNA的附著，并包被金顆粒的表面。而在帶正電荷的GNP的情況中，靜電力和范德華力可以促成DNA的包被或附著。

在金屬納米顆粒外，還已經使用大小范圍在3-5nm內的半導體納米顆粒(例如量子點)(“QD”)作為載體來將分子投遞到細胞中。DNA和蛋白質可以包被或連接到用配體多官能化的QD表面(參見，例如Patolsky，F.等，J.Am.Chem.Soc.125，13918(2003))。可以通過使用標準的生物綴合方案(參見例如Pinaud，F.，D.King，H.-P.Moore，S.Weiss，J.Am.Chem.Soc.126，6115(2004)；Bruchez，M..，M.Moronne，P.Gin，S.Weiss，A.P.Alivisatos，Science?281，2013(1998))來將經羧酸或胺多官能化的QD與含有硫醇基團(參見例如Dubertret?B等，Science?298，1759(2002)；Akerman，M.E.，W.C.W.Chan，P.Laakkonen，S.N.Bhatia，E.Ruoslahti，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，12617(2002)；Mitchell，G.P.，C.A.Mirkin，R.L.Letsinger，J.Am.Chem.Soc.121，8122(1999))或N-羥基琥珀酰亞氨基(NHS)酯基團的分子交聯。一種備選的方式是經由與鏈霉親合素的綴合來多官能化QD。鏈霉親合素與生物素化的蛋白質、寡聚物或抗體綴合(參見例如Dahan?M.等，Science?302，442(2003)；Pinaud，F.，D.King，H.-P.Moore，S.Weiss，J.Am.Chem.Soc.126，6115(2004)；Dahan?M.等，Science?302，442(2003)；Wu.X.Y.等，Nature?Biotechnol.21，41(2003)；Jaiswal，J.K.，H.Mattoussi，J.M.Mauro，S.M.Simon，Nature?Biotechnol.21，47(2003)；及Mansson，A.等，Biochern.Biophys.Res.Commun.314，529(2004)。

已經使用納米顆粒來將質粒DNA投遞到多種動物細胞。已經發現了，在將經DNA包被的納米顆粒與沒有細胞壁的細胞一起溫育時，細胞吸收該納米顆粒，并開始表達DNA上編碼的任何基因。在期望對通常具有細胞壁的細胞進行的納米顆粒投遞的情況中，在將所述顆粒添加至原生質體前將細胞壁剝離(參見Torney，F.等，Nature?Nanotechnol.2，(2007)。在植物細胞中，細胞壁充當投遞外源應用的分子的屏障。已經采用許多侵入性方法，如基因槍(生物射彈)、顯微注射、電穿孔、和土壤桿菌(Agrobacterium)來實現將基因和小分子投遞至這些有壁的植物細胞中。將小分子和蛋白質投遞穿過細胞壁并進入植物細胞中對于開發使得體外和體內操作完整植物的細胞、組織、和器官能夠進行的技術會是有利的。