[發(fā)明專利]產(chǎn)生C4二羧酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080012963.3
• 申請日: 2010-03-23
• 公開（公告）號: CN102361881A
• 公開（公告）日: 2012-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 貝絲·范特蘭德-布魯姆;約翰·拉雅帕蒂
• 申請（專利權(quán)）人: 阿徹丹尼爾斯米德蘭德公司
• 主分類號: C07H21/00
• 分類號: C07H21/00;C12N15/63
• 代理公司: 北京安信方達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262
• 代理人: 陶貽豐;鄭霞

發(fā)明人

貝絲·范特蘭德-布魯姆

約翰·拉雅帕蒂

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明大體上涉及C4二羧酸的產(chǎn)生。

背景

二羧酸包括兩個羧酸基團并具有很多用途，包括但不限于，食品添加劑、聚合物增塑劑、溶劑、潤滑劑、工程塑料、環(huán)氧樹脂固化劑、粘合劑和粉末涂料、腐蝕抑制劑、化妝品、藥物和電解質(zhì)。二羧酸還可轉(zhuǎn)化為它們的酯形式以用于多種不同的用途。

二羧酸諸如蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸可通過化學(xué)合成或發(fā)酵來產(chǎn)生。因為通過化學(xué)合成產(chǎn)生二羧酸可能導(dǎo)致有害的廢棄副產(chǎn)物，存在通過發(fā)酵產(chǎn)生二羧酸的需要。

蘋果酸是在食品生產(chǎn)工業(yè)中具有用途的有機酸，且用于制造化妝品。蘋果酸還作為表面活性劑或生物可降解聚合物用于化學(xué)工業(yè)中。還可對蘋果酸進行多種加工以產(chǎn)生羥基丁內(nèi)酯和羥基琥珀酸衍生物，馬來酸酐和1，4-丁二醇。

延胡索酸是自然界中廣泛存在的有機酸。在人類和其它哺乳動物中，延胡索酸是用于有機酸生物合成的三羧酸循環(huán)(也稱作Krebs循環(huán)或檸檬酸循環(huán))中的關(guān)鍵中間物。延胡索酸還是植物生命中的必需成分，并可在食品工業(yè)中具有用途；在蘋果酸和天冬氨酸的產(chǎn)生中作為化學(xué)中間物；在聚酯樹脂或多元醇的制造中作為工業(yè)化學(xué)物；作為染料的媒染劑；或可用于多種工業(yè)化學(xué)物的產(chǎn)生。

琥珀酸是可用作表面活性劑、去垢劑、增充劑或發(fā)泡劑的有機酸。琥珀酸還可作為鐵螯合劑，用于食品或飼料工業(yè)、用于藥品或保健用品市場或作為植物興奮劑(plant?stimulant)。如蘋果酸和延胡索酸一樣，琥珀酸還可在諸如己二酸、4-氨基丁酸、天冬氨酸、1，4-丁二醇、琥珀酸二乙酯、乙二胺二琥珀酸、延胡索酸、γ-丁內(nèi)酯、羥基琥珀酰亞胺、衣康酸、馬來酸、馬來酸酐、馬來酰亞胺、蘋果酸、N-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、琥珀酰亞胺、四氫呋喃或其它4-碳化合物的產(chǎn)生中用作工業(yè)化學(xué)物。琥珀酸還可用于產(chǎn)生生物可降解聚合物。

概述

本發(fā)明滿足了這些需要，并公開了通過發(fā)酵產(chǎn)生C4二羧酸的方法。

在一個實施方案中，分離的或重組的多核苷酸包括選自由以下組成的組的序列：編碼包括SEQ?ID?NO：2的多肽的多核苷酸序列；與編碼包括SEQ?ID?NO：2的多肽的多核苷酸序列完全互補的核苷酸序列；和在嚴格條件下與和編碼包括SEQ?ID?NO：2的多肽的多核苷酸序列完全互補的核苷酸序列雜交的序列，所述嚴格條件包括65℃下0.2×SSC。

在另一個實施方案中，載體包括啟動子和用于表達根霉屬(Rhizopus)來源的丙酮酸羧化酶蛋白的元件(means)。

在又一個實施方案中，產(chǎn)生C4二羧酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用選自由以下組成的組的序列轉(zhuǎn)化的重組細胞：SEQ?ID?NO：1；SEQ?ID?NO：1的全長互補序列(complement)；與SEQ?ID?NO：1具有至少95％序列同一性且編碼具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的序列；編碼包括SEQ?ID?NO：2的氨基酸序列的多肽的序列；和編碼具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的多核苷酸序列，其中該多核苷酸與多核苷酸SEQ?ID?NO：1的全長互補序列在嚴格條件下雜交，所述嚴格條件包括65℃下0.2×SSC；和從培養(yǎng)基回收C4二羧酸。

附圖簡述

圖1是米根霉(R.oryzae)中常見代謝途徑的圖解。

圖2顯示米根霉、釀酒酵母(S.cerevisiae)、黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)丙酮酸羧化酶蛋白之間保守的結(jié)構(gòu)域。在這些真菌蛋白之間，兩個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和生物素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是100％保守的，而丙酮酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域為89％保守的。

圖3A-C顯示米根霉1526丙酮酸羧化酶的cDNA序列(SEQ?ID?NO：1)(圖3A-B)和蛋白序列(SEQ?ID?NO：2)(圖3C)。開放閱讀框編碼1179個氨基酸的蛋白。

圖4顯示利用限制性酶PstI、BamHI或EcoRI消化的來自米根霉的總基因組DNA的DNA印跡，顯示含有丙酮酸羧化酶(pyrC)的質(zhì)粒的相關(guān)拷貝數(shù)。

圖5是Ptef:pyrC:Tpgk?pyr225b質(zhì)粒圖譜。

圖6是pyrC?fum?pyrG?YEM7質(zhì)粒圖譜。

發(fā)明詳述