[發明專利]用于檢測乙型肝炎病毒的寡核苷酸探針及引物

無效

• 申請號: 201080007639.2
• 申請日: 2010-01-27
• 公開（公告）號: CN102317474A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 曼尤拉·賈甘納特;錢德拉塞克哈爾·布哈斯卡拉恩·奈爾;皮拉里塞蒂·文卡塔·蘇巴拉奧
• 申請（專利權）人: 彼格泰格私人有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 李丙林;張英

技術領域

本發明涉及檢測樣品中HBV(乙型肝炎病毒)核酸存在和定量的方法。

背景技術

HBV導致了急性和慢性肝炎(乙型肝炎)，而在嚴重情況下導致肝硬化和肝癌。近來的研究表明，全世界感染乙型肝炎病毒(HBV)的人數總計達到約300百萬。

用于直接檢測感染主體的血液/血清或血漿中的HBV核酸的基于PCR分析，可以提供測定受感染患者精確病毒載量的優點，這種精確的病毒載量對于醫師知曉感染的準確階段是有用的。這可以進一步幫助醫師對患者提供正確的療法。量化精確的病毒載量也能夠有助于監控抗病毒療法的進展。目前所用的HBV診斷方法是基于ELISA(酶聯免疫吸附實驗)的，這是基于血清標記物，如HbeAg、HbsAg或抗-HBc?IgM、抗-Hbe、抗-HBs或抗-HBc?IgG的存在。因為基于ELISA的方法不能提供精確的病毒載量，則需要尋找能夠提供定量測定病毒載量的方法。就前述有關已知檢測方法的問題而言，還需要有效的方法，才能使其用于檢測HBV以能夠提供病毒載量的定性和定量測定。

發明內容

目的

本發明的第一個目的是提供一種測定樣品中HBV核酸存在的方法。

本發明的第二個目的是提供用于檢測HBV的探針和引物。

本發明的第三個目的是提供用于檢測HBV的PCR反應混合物。

本發明的第四個目的是提供包含用于檢測HBV的探針和引物的試劑盒。

因此，本發明涉及寡核苷酸探針SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2；引物SEQ?ID?No.3、4、5和6；用于檢測乙型肝炎病毒的PCR反應混合物，所述混合物包含核酸擴增試劑、SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2中列出的雙重標記的探針、引物SEQ?ID?No.3、4、5、6和測試樣品；檢測乙型肝炎病毒的方法，所述方法包含以下步驟：形成包含核酸擴增試劑、分別具有對應的引物SEQ?ID?No.3和4或SEQ?ID?No.5和6的寡核苷酸探針SEQ?ID?No.1或SEQ?ID?No.2、測試樣品的反應混合物；和將所述反應混合物進行PCR而獲得所述靶序列的拷貝接著測定用于檢測所述乙型肝炎病毒的熒光信號的增加；以及用于檢測乙型肝炎病毒的試劑盒，所述試劑盒包含SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2的雙重標記的探針，單獨地或組合地；對應引物對SEQ?ID?No.3、4和5、6，單獨地或組合地，以及擴增試劑。

附圖說明

圖1是使用商購試劑盒的HBV陽性樣品的實時曲線圖。

圖2是使用SEQ?ID?No.1的HBV陽性樣品的實時曲線圖。

圖3是使用SEQ?ID?No.2的HBV陽性樣品的實時曲線圖。

圖4是使用SEQ?ID?No.1的HBV陰性樣品的實時曲線圖。

圖5是使用SEQ?ID?No.2的HBV陰性樣品的實時曲線圖。

圖6是HBV-標準曲線。

具體實施方式

本發明涉及寡核苷酸探針SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2。

在本發明的一個實施方式中，所述探針是雙重標記的探針。

在本發明的一個實施方式中，所述探針檢測乙型肝炎病毒。

在本發明的一個實施方式中，所述探針與在5′端具有熒光團而在內部區域或在3′端具有淬滅基團的可檢測標記結合。

在本發明的一個實施方式中，所述SEQ?ID?No.1被設計針對乙型肝炎病毒的表面基因，而SEQ?ID?No.2被設計針對乙型肝炎病毒的X-基因區域。

本發明涉及引物SEQ?ID?No.3、4、5和6。

在本發明的一個實施方式中，所述引物SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.5分別是正義的引物，而SEQ?ID?No.4和SEQ?ID?No.6分別是反義的引物。

在本發明的一個實施方式中，所述引物SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4用于SEQ?ID?No.1的雙重標記的探針，而引物SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6用于SEQ?ID?No.2的雙重標記的探針。

本發明涉及用于檢測乙型肝炎病毒的PCR反應混合物，所述混合物包含核酸擴增試劑、SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2中列出的雙重標記的探針、引物SEQ?ID?No.3、4、5、6和測試樣品。

在本發明的一個實施方式中，所述樣品選自由血液、血清和血漿組成的組。

在本發明的一個實施方式中，所述PCR是實時PCR。