[發(fā)明專(zhuān)利]粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化體以及異源蛋白質(zhì)的制造方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080006331.6
• 申請(qǐng)日: 2010-01-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102292442A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 浜祐子;依地?zé)崴埂ぐ⒗锬窘?/a>;東田英毅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 旭硝子株式會(huì)社
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/09
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/09;C12N1/19;C12P21/00
• 代理公司: 上海專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 馮雅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces?pombe)的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化體以及異源蛋白質(zhì)的制造方法。

背景技術(shù)

利用轉(zhuǎn)化體制備異源蛋白質(zhì)的技術(shù)在各個(gè)產(chǎn)業(yè)被廣泛應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)化體是利用基因重組技術(shù)導(dǎo)入了編碼宿主本身無(wú)法生產(chǎn)的異源蛋白質(zhì)的外源基因(異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因)的轉(zhuǎn)化體。在這樣的異源蛋白質(zhì)的制造中，尤其是制造來(lái)源于真核生物的蛋白質(zhì)的情況下，認(rèn)為作為宿主利用屬于真核生物的微生物的方法較為理想。尤其是，從酵母中不含有對(duì)人體帶來(lái)不良影響的物質(zhì)，且其為單細(xì)胞而容易操作等方面考慮，開(kāi)發(fā)了很多將酵母用作宿主的表達(dá)系統(tǒng)。

其中，已知與釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)等出芽酵母相比，屬于裂殖酵母的Schizosaccharomyces?pombe(下稱(chēng)粟酒裂殖酵母)的細(xì)胞周期和染色體結(jié)構(gòu)、RNA剪接等與動(dòng)物細(xì)胞更為相似，所生成的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾也與動(dòng)物細(xì)胞接近，因而可進(jìn)行更為復(fù)雜的翻譯后修飾。

將粟酒裂殖酵母用作宿主的異源蛋白質(zhì)的制造中，以往在粟酒裂殖酵母中導(dǎo)入表達(dá)載體(該載體具有異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因、啟動(dòng)子以及終止子)，使該表達(dá)載體以染色體外基因組(質(zhì)粒)的方式存在。但是，這種情況下，在粟酒裂殖酵母的培養(yǎng)中這些表達(dá)載體有可能從細(xì)胞脫離而消失，因此，需要利用營(yíng)養(yǎng)需求性互補(bǔ)或耐藥性積極維護(hù)質(zhì)粒。為此，作為更為穩(wěn)定地生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，公開(kāi)了利用通過(guò)同源重組將表達(dá)載體整合到粟酒裂殖酵母的染色體的轉(zhuǎn)化體的方法。

專(zhuān)利文獻(xiàn)

專(zhuān)利文獻(xiàn)1：日本專(zhuān)利特開(kāi)2000-262284號(hào)公報(bào)

發(fā)明概要

專(zhuān)利文獻(xiàn)1中記載的轉(zhuǎn)化體中，傳代超過(guò)50代后整合到染色體的表達(dá)載體仍以未脫離的狀態(tài)存在。但是，在工業(yè)上制造異源蛋白質(zhì)時(shí)，要求更長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)培養(yǎng)中的異源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定生成，因此，希望進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化體在傳代中的維持穩(wěn)定性。

因此，本發(fā)明的目的在于能夠獲得在傳代中的維持穩(wěn)定性更佳，且可穩(wěn)定地制備目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法、其轉(zhuǎn)化體以及利用該轉(zhuǎn)化體的異源蛋白質(zhì)的制造方法為目的。

以下表示本發(fā)明的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法、轉(zhuǎn)化體以及利用該轉(zhuǎn)化體的異源蛋白質(zhì)的制造方法。

〔1〕粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，它是利用具有表達(dá)盒和重組位點(diǎn)的載體通過(guò)同源重組將所述表達(dá)盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizoasccharomyces?pombe)的染色體中的轉(zhuǎn)化方法，所述表達(dá)盒包含在所述粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動(dòng)子、異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因以及終止子，所述重組位點(diǎn)與所述粟酒裂殖酵母的染色體進(jìn)行同源重組，其特征在于，所述重組位點(diǎn)的堿基序列為將實(shí)質(zhì)上具有同一堿基序列的位點(diǎn)作為靶位點(diǎn)且能夠與該靶位點(diǎn)進(jìn)行同源重組的序列，該位點(diǎn)分別存在于所述粟酒裂殖酵母的多個(gè)染色體中的各個(gè)不同的染色體和/或以其間夾有一個(gè)以上的必需基因的方式存在于同一染色體的多個(gè)位置。

〔2〕前述〔1〕所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法中，在粟酒裂殖酵母的染色體中存在5個(gè)以上的所述靶位點(diǎn)。

〔3〕前述〔1〕或〔2〕所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法中，所述靶位點(diǎn)為轉(zhuǎn)座子基因Tf2中的堿基序列。。

〔4〕粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，它是利用具有表達(dá)盒和重組位點(diǎn)的載體通過(guò)同源重組將所述表達(dá)盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces?pombe)的染色體的靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化方法，所述表達(dá)盒包含在所述粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的啟動(dòng)子、異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因以及終止子，所述重組位點(diǎn)與所述粟酒裂殖酵母的染色體進(jìn)行同源重組，其特征在于，所述粟酒裂殖酵母染色體的靶位點(diǎn)為轉(zhuǎn)座子基因Tf2中的堿基序列。

〔5〕前述1～4中任一項(xiàng)所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法中，選擇在2個(gè)以上的所述靶位點(diǎn)上整合有所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化體。

〔6〕前述1～5中任一項(xiàng)所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法中，所述載體包含2個(gè)以上的表達(dá)盒。

〔7〕前述1～6中任一項(xiàng)所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法中，進(jìn)行同源重組后，選擇整合于所述染色體的表達(dá)盒的總數(shù)為3～40個(gè)的轉(zhuǎn)化體。

〔8〕前述1～7中任一項(xiàng)所述的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述表達(dá)盒中的異源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的5’末端側(cè)具有在粟酒裂殖酵母內(nèi)起作用的分泌信號(hào)基因。

〔9〕由前述1～8中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)化體。