[發明專利]改良的等溫鏈置換擴增

無效

• 申請號: 201080004990.6
• 申請日: 2010-01-15
• 公開（公告）號: CN102282258A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 道格拉斯·斯潘塞·米勒;克萊雷·凱特·英曼
• 申請（專利權）人: 人類遺傳標記控股有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 隆天國際知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;任曉華

技術領域

本發明涉及在基本沒有熱循環下擴增核酸分子的改良方法。

技術背景

用于從核酸序列群內擴增特定序列的最常見方法是聚合酶鏈式反應(PCR)(Dieffenbach?C?and?Dveksler?G?eds.?PCR?Primer：A?Laboratory?Manual.Cold?Spring?Harbor?Press，Plainview?NY)。在這種擴增方法中，利用寡核苷酸在變性的單鏈DNA模板上引導DNA合成，所述寡核苷酸的長度通常為15-30個核苷酸，位于互補鏈上且在待擴增區域的兩端。利用熱穩定DNA聚合酶進行變性、引物雜交和DNA鏈合成的連續循環可指數級擴增所述引物之間的序列。RNA序列的擴增可以通過首先利用逆轉錄酶復制以產生cDNA拷貝來進行。可以利用包括凝膠電泳、與標記探針雜交、使用可隨后鑒定(例如通過酶聯檢測)的標簽引物、使用與靶DNA雜交時產生信號的熒光標簽引物(例如Beacon和TaqMan系統)在內的多種方法檢測所擴增的DNA片段。

PCR的缺點之一是需要熱循環儀加熱和冷卻擴增混合物以使DNA變性。這樣，擴增不能在原始位點進行，也不易于在實驗室之外的環境中操作。

除PCR之外，還開發了其它多種用于檢測和擴增特定序列的技術。其中一個實例是連接酶鏈式反應(Barany?F?Genetic?disease?detection?and?DNA?amplification?using?cloned?thermostable?ligase.?Proc.?Natl.?Acad.?Sci.?USA88：189-193，1991)。

除了依賴于擴增反應期間靶標熱變性的常規DNA擴增方法外，還描述了不需要在擴增反應期間進行模板變性的很多方法，其因此被稱作等溫擴增技術。

等溫擴增技術最早見于1992年(Walker?GT，?Little?MC，Nadeau?JG?and?Shank?D.?Isothermal?in?vitro?amplification?of?DNA?by?a?restriction?enzyme/DNA?polymerase?system.PNAS?89：392-396，1992)，并被稱為鏈置換擴增(SDA)。此后，還描述了很多其它等溫擴增技術，包括轉錄介導的擴增(TMA)和基于核酸序列的擴增(NASBA)，其使用RNA聚合酶以復制RNA序列而不是對應的基因組DNA(Guatelli?JC，Whitfield?KM，Kwoh?DY，Barringer?KJ，Richmann?DD?and?Gingeras?TR.Isothermal，in?vitro?amplification?of?nucleic?acids?by?a?multienzyme?reaction?modeled?after?retroviral?replication.PNAS?87：1874-1878，1990；Kievits?T，?van?Gemen?B，van?Strijp?D，Schukkink?R，Dircks?M，Adriaanse?H，Malek?L，Sooknanan?R，Lens?P.?NASBA?isothermal?enzymatic?in?vitro?nucleic?acid?amplification?optimized?for?the?diagnosis?of?HIV-1infection.J?Virol?Methods.1991Dec；35(3)：273-86)。