[發(fā)明專利]改良的等溫鏈置換擴(kuò)增

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080004990.6
• 申請日: 2010-01-15
• 公開（公告）號: CN102282258A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 道格拉斯·斯潘塞·米勒;克萊雷·凱特·英曼
• 申請（專利權(quán)）人: 人類遺傳標(biāo)記控股有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 隆天國際知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;任曉華

1.一種DNA等溫?cái)U(kuò)增方法，其包括：

向待擴(kuò)增的DNA提供擴(kuò)增混合物，所述擴(kuò)增混合物包含：

與DNA區(qū)至少部分互補(bǔ)且包含黃嘌呤核苷的第一引物，

與DNA區(qū)至少部分互補(bǔ)且包含黃嘌呤核苷的第二引物，

DNA聚合酶，

能夠進(jìn)行鏈置換的酶，

識別雙鏈DNA中的黃嘌呤核苷并在一條DNA鏈中的黃嘌呤核苷位點(diǎn)或在黃嘌呤核苷附近引起切口或堿基切除的酶；和

在基本沒有熱循環(huán)下擴(kuò)增DNA。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述DNA在添加所述擴(kuò)增混合物之前、期間或之后變性。

3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述第一引物與所述DNA的第一鏈區(qū)至少部分互補(bǔ)，并且第二引物與DNA的第二鏈的DNA區(qū)至少部分互補(bǔ)。

4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一引物和第二引物是寡核苷酸、寡核苷酸類似物或嵌合性寡核苷酸。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述引物是脫氧寡核苷酸。

6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述引物是選自以下組成的組中的寡核苷酸類似物：插入核酸(INA)、肽核酸(PNA)、己糖醇核酸(HNA)、MNA、阿卓糖醇核酸(ANA)、鎖核酸(LNA)、環(huán)己基核酸(CAN)、CeNA、TNA、(2’-NH)-TNA、基于核酸的結(jié)合物、(3’-NH)-TNA、α-L-核糖-LNA、α-L-木糖-LNA、β-D-木糖-LNA、α-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-氨基-雙環(huán)-DNA、5-表-雙環(huán)-DNA、α-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-吡喃來蘇糖-NA、2’-R-RNA、2’-OR-RNA、α-L-RNA、β-D-RNA及其混合物和雜交物，以及其磷原子修飾物。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述引物包含一個(gè)或多個(gè)插入性假核苷酸。

8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述引物可以具有兩個(gè)或更多個(gè)黃嘌呤核苷，它們彼此相鄰或之間間隔至少幾個(gè)常規(guī)堿基。

9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述DNA聚合酶選自以下組成的組：Taq聚合酶Stoffel片段、Taq聚合酶、高級DNA聚合酶、AmpliTaq、Amplitaq?Gold、Titanium?Taq聚合酶、KlenTaq?DNA聚合酶、Platinum?Taq聚合酶、Accuprime?Taq聚合酶、Pfu聚合酶、Pfu?turbo聚合酶、Vent聚合酶、Vent?exo-聚合酶、Pwo聚合酶、9°N_m?DNA聚合酶、Therminator、Pfx?DNA聚合酶、Expand?DNA聚合酶、rTth?DNA聚合酶、DyNAzyme^TM?EXT聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶1、DNA聚合酶、T7聚合酶、Sequenase^TM、T4DNA聚合酶、Bst聚合酶、Bca聚合酶、Tfi聚合酶、phi-29DNA聚合酶、DNA聚合酶Beta及其修飾形式。

10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述鏈置換酶選自以下組成的組：解旋酶、AP核酸內(nèi)切酶和能夠進(jìn)行鏈置換的錯配修復(fù)酶或能夠進(jìn)行鏈置換的修飾酶。

11.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述DNA聚合酶還具有鏈置換能力，并且選自以下組成的組：Klenow?exo-、Bst?DNA聚合酶大片段、Bca聚合酶、Vent?exo-、Deep?Vent?exo-、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、9°N_mDNA聚合酶和Phi29DNA聚合酶。

12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是Klenow?Exo-或Bst聚合酶。

13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是核酸外切酶缺陷型。

14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述能夠識別雙鏈DNA中黃嘌呤核苷的酶是核酸內(nèi)切酶V、hOGG1或Fpg。