[實用新型]一種紫杉醇產生菌發酵紅豆杉枝葉生產紫杉醇新方法

有效

• 申請號: 201020165294.0
• 申請日: 2010-04-24
• 公開（公告）號: CN101892162A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發明（設計）人: 程斌;李耀亭;鄭蕾;萬賓;劉體云;潘勤;熊春盛
• 申請（專利權）人: 程斌
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P17/02;C12R1/645
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技術領域

本發明涉及一種紫杉醇產生菌株的分離選育方法和利用該菌株發酵紅豆杉枝葉轉化紫杉醇前體物，提高紫杉醇得率的工藝技術。

背景技術

紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復雜的次生代謝產物，由紅豆杉樹干、樹皮或針葉中提取或半合成的有效成分，也是目前所了解的惟一一種可以促進微管聚合和穩定已聚合微管的藥物。通過II-III臨床研究，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。由于其作用機制獨特，對很多耐藥病人有效，成為目前最熱門的抗腫瘤藥物之一。

紅豆杉是一種生長緩慢的喬木，分布于北半球的溫帶至亞熱帶地區，我國有四種和一個變種(南方紅豆杉)，但是全世界資源總量卻極其有限，散生分布于天然林中。目前全世界的紫杉醇需求量在每年數十至數百噸紫杉醇純品，尋求新的來源成為主要的研究方向。

1、從紅豆杉的不同部位提取紫杉醇

主要通過紅豆杉樹皮提取生產紫杉醇，但是對野生資源破壞巨大，人們試圖從紅豆杉植株的其他部位提取以擴大紫杉醇來源，Kelth?Witherup測定了6種紅豆杉枝葉和莖中的紫杉醇含量，發現針葉中的紫杉醇含量較高。

2、良種繁育、人工栽培

為彌補天然資源的奇缺，國內外的工作人員進行紅豆杉良種選育和扦插快繁技術研究，其中賓夕法尼亞大學國家天然產物技術中心已篩選出高紫杉醇含量的植株供人工栽培，美國農業部和密西西比大學聯合栽培紅豆杉規模達數百萬株，3～5年即可收割。

3、化學合成紫杉醇

①全合成紫杉醇

美國佛羅里達州立大學的化學教授豪頓以樟腦為起始材料，采用線性合成法，于1993年12月完成紫杉醇全合成；Scipps研究所1992年報告先合成兩個六元環，再將其連續形成以八元環為中心的中間體，然后再合成四元環，從而完成紫杉醇的全合成。但是兩種全合成途徑都包括25～30步的化學反應復雜過程，距工業化生產尚有很大距離。

②半合成紫杉醇

1988年，法國Denis首次報道了從歐洲紅豆杉的針葉中獲得10-乙酰漿果赤霉素III(baccatin-III)，以此為原料半合成了紫杉醇及其同系物texotere。隨后美國Rhone-Poulene?Rorer化學公司也實現了紫杉醇的半合成，并申請了以baccatin-III為原料半合成紫杉醇的專利。美國BMS公司計劃在獲得美國FDA批準后，停止從樹皮中萃取紫杉醇的生產活動，利用半合成法進行工業化生產紫杉醇。

4、利用植物細胞工程方法生產紫杉醇

利用植物細胞培養法生產紫杉醇，該方法曾經一度是各種研究方向中十分有吸引力的一個方向，也是1990年美國NCI主持召開的紫杉醇研討會上，得到NCI投資的方向之一，但是十年來沒有突破性進展。

5、紫杉醇類似物

目前世界各國科學家從紅豆杉屬植物中分離得到200多種化合物，都具有紫杉烷三環二萜的基本骨架，部分具有抗腫瘤活性。

綜合分析，目前國內外對紫杉醇的研究方向很多，但是沒有成型的可進行工業化生產，主要原因為紅豆杉資源不足，栽培的樹種生長緩慢，不能短時間內提供足夠原料；紫杉醇分子式結構復雜，很難進行化學合成的工業化生產，細胞培養方法由于發酵周期長且高產細胞株選育耗時長，中試投產都有一定困難。于是，國內外學者開始轉向真菌發酵法生產紫杉醇，目前遇到的關鍵問題是紫杉醇產生菌的分離和發酵液中紫杉醇含量的提高成為技術瓶頸。

發明內容

為進行紫杉醇的工業化生產，本發明通過生產實踐，研究出一種新型的紫杉醇生產工藝。包括以下步驟：

1、紫杉醇產生菌的選育：采用分離自南方紅豆杉韌皮部的真菌，經過紫外線誘變，篩選出紫杉醇前體物轉化活性強、增殖速度快的“WM20094001”號菌株作為生產菌株。

2、“WM20094001”號菌株斜面培養基配方為固體MS培養基，搖瓶培養基為液體MS培養基，發酵培養基為液體MS培養基。

3、紫杉醇生產菌發酵72h左右的發酵液用自行研制的營養液稀釋5倍后，拌入經前處理的紅豆杉枝葉，20℃～25℃條件下處理120h左右，轉化紫杉醇前體物。

4、紅豆杉枝葉處理采用熱蒸汽瞬時表面脫蠟和消毒，平鋪于發酵床上，采用通風發酵的方式進行發酵。

5、發酵后，機械攪拌成糊狀，加入三倍體積95％乙醇，攪拌均勻，靜置浸提30min，提取液經離心去渣，于40℃以下真空干燥，獲得浸膏狀產品。

本發明的創新體現在以下幾個方面：