[發明專利]全細胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術

無效

• 申請號: 201019026027.7
• 申請日: 2010-02-04
• 公開（公告）號: CN101768617A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發明（設計）人: 應漢杰;姚月蘭;熊健;陳勇;柏建新;苑巍;張磊
• 申請（專利權）人: 南京工業大學;南京同凱兆業生物技術有限責任公司
• 主分類號: C12P19/40
• 分類號: C12P19/40;C12R1/645;C12R1/85;C12R1/84;C12R1/78
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明涉及一種由脫氧核苷一磷酸dNMP合成脫氧核苷三磷酸dNTP的方法。?

背景技術

脫氧核苷三磷酸是人工合成DNA的必備前體原料，人工合成DNA片段廣泛應用于基因工程、分子生物學、生命科學、基因藥物等方面。三磷酸脫氧核苷是各種DNA聚合酶促反應的底物，是DNA序列分析、基因分析、定點突變、PCR(Polymerase?ChainReaction)、RT-PCR、反轉錄和DNA標記反應不可缺少的低分子量生物有機分子。而DNA序列分析、定點突變、PCR及DNA芯片技術是現代分子生物學、生物化學和現代生物醫學研究不可缺少的技術。尤其是PCR技術具有操作簡單應用廣泛等特點，它在基因分子克隆、蛋白質工程、生物醫藥研發、遺傳和傳染性疾病診斷、法醫鑒定、親子檢定等領域得到越來越廣泛的應用。?

隨著生物技術研究和工業化中DNA合成的PCR應用，dNTP的需求在穩定地增長。目前世界上只有少數幾家企業能夠生產三磷酸脫氧核苷，所采用的方法主要是利用脫氧核糖核酸水解產物的酶促或化學磷酸化，終產物的獲得要求多步反應，生產工藝繁瑣，產物轉化率低。?

商業上主要通過化學方法生產dNTP，反應是以dNMP相應的三丁基銨鹽和正磷酸為底物，以二環己基碳二亞胺(DCC)為催化劑，在吡啶或者二甲基酰胺(DMF)等有機溶劑中進行。化學法生產得到不同dNTP的產率為40～80％。然而，純化反應混合物中的各個dNTP組分，其過程十分復雜并且成本很大，它需要分離非活性的dNMP、dNDP、DCC和正磷酸以及副產物如脫氧核糖核苷四磷酸或五磷酸等。另外，因為廢氣處理的原則很嚴格，吡啶或者DMF溶劑一定要被還原，分離，然后回收。因此，化學法有很大的環境污染，并且通過反應和純化后它的得率很低，成本也相對較高。?

從經濟和環境因素考慮，近年世界上已出現酶法合成脫氧核苷三磷酸，此法比化學方法更具優勢。dNTP的合成需要兩個酶磷酸化的反應，從dNMP生成dNDP和第二步生成dNTP。Ladner和Whitesides由從鯡魚精子DNA中分離的脫氧核苷一磷酸(dNMP)混合物合成dNTP[Ladner?W，Whitesides?G.Enzymatic?synthesis?of?deoxyATP?using?DNAas?starting?material[J].J?Org?Chem，1985，50：1076-1079]。近年來，Jie?Bao，Dewey?D.Y.Ryu等人成功將編碼四種脫氧核苷單磷酸激酶的基因從Saccharomyces?cerevisiae?ATCC2610菌株的基因組中分離出來，分別為編碼脫氧腺苷酸激酶(AK)的ADK1，編碼脫氧鳥苷酸激酶(GK)的GUK1，編碼脫氧胞苷酸激酶(CK)的URA6，以及編碼脫氧?胸苷酸激酶(TK)的CDC8基因。他們將這些基因克隆到E.coli?BL21(DE3)菌株中，并使AK，GK，CK，TK過量表達。用純化的脫氧核苷酸激酶實現從脫氧核苷單磷酸到脫氧核苷二磷酸的轉化。第二步加入從家兔肌肉中提取的丙酮酸激酶(PK)實現從dNDP到dNTP的轉化[Bao?J，Ryu?DDY.Total?Biosynthesis?of?Deoxynucleoside?Triphosphates?UsingDeoxynucleoside?Monophosphate?Kinases?for?PCR?Application[J].Biotechnol?Bioeng.2007，98(1)：1-11]。盡管如此，dNTP的產率仍較低，只有25％左右[Bao?J，Bruque?GA，RyuDDY.Biosynthesis?of?deoxynucleoside?triphosphates，dCTP?and?dTTP：Reaction?mechanismand?kinetics[J].Enzyme?Microb?Technol.2005，36：350-356；Bao?J，Ryu?DDY.Biosynthesisreaction?mechanism?and?kinetics?of?deoxynucleoside?triphosphates，dATP?and?dGTP[J].Biotechnol?Bioeng.2005，89：485-491]。另外，世界上已有數家研究機構正在研發核苷酸還原酶，但這些正處在研發階段的核苷酸還原酶大都有反應條件復雜和酶穩定性差等缺點，不適合工業化，應用范圍有限。?