[發明專利]一種制備組織工程角膜的方法

有效

• 申請號: 201019018003.7
• 申請日: 2010-02-05
• 公開（公告）號: CN101757690A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 王愛軍
• 申請（專利權）人: 陜西瑞盛生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/36
• 代理公司: 中國科學院西安專利中心 61001
• 代理人: 任越

技術領域

本發明屬于生物材料的組織工程技術領域，具體涉及一種組織工程角膜 的制備方法。

背景技術

眼球的解剖特點決定了眼球位置暴露、組織結構脆弱，很小的外力或異 物均可造成嚴重的損害，此外，一些角膜疾病包括感染性角膜病、角膜變性、 營養不良和免疫性角膜病等，均可導致角膜損傷。而一旦損傷，將嚴重影響 視覺、或導致失明。角膜病損是僅次于白內障的第二大致盲性眼病，并以每 年150萬～200萬病例的速度遞增。而角膜移植術是治療角膜病損最有效的 手段，傳統角膜移植的供體主要來自尸體和捐獻。目前，我國約有400萬角 膜盲患者，許多是可以通過角膜移植治療復明，但由于供體的角膜來源非常 有限，限制了角膜修復手術的開展。組織工程技術的興起為各種可導致失明 的角膜疾病治療帶來了希望。組織工程角膜是應用細胞生物學和組織工程學 原理構建種子細胞與生物材料的復合體，移植后具有改善病損角膜組織形 態、結構和功能的作用。但其中起關鍵作用的種子細胞的來源問題目前尚未 解決，而獲取自體角膜細胞將不可避免地破壞健康眼，尋找其他來源的種子 細胞就成為解決問題的關鍵。

研究表明，成體干細胞存在于許多成體組織器官中，具有多向分化及橫 向分化的能力，對組織的修復和內環境的穩定具有重要作用。羊膜位于胚胎 胎膜的最內層，由單層的上皮細胞、及其下面的基底膜和含有基質細胞的海 綿層組成，其中包含大量的干細胞。從胚胎發育的角度看，羊膜細胞來源于 不同胚層：人羊膜上皮細胞(hAECs)來源于受精后第八天的胚胎外胚層，人 羊膜基質細胞(hAMCs)來源于原條的胚外中胚層。研究證明，來源于羊膜組 織的細胞表達干細胞標志物，包括Oct24、GA?TA22、GA?TA24、Pax26、TRA21260、 SSEA23、SSEA24、STA?T23、Rex2、神經細胞粘附分子、巢蛋白、骨形態蛋 白2/4、肝細胞核因子24α、波形蛋白、CK218、Sox22、歸巢細胞粘附分子21、 Brachyury和Notch21等，并能夠分化成為多種成熟細胞，如脂肪細胞、骨 細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、肝細胞、神經細胞和血管內皮細 胞。而且羊膜干細胞具有非常強的擴增能力，體外培養21d后傳至第3代的 hAMCs數量擴增約300倍。hAMCs中Oct24轉錄產物表達水平高于骨髓基質細 胞，其編碼蛋白Oct24是維持干細胞更新能力和胚胎干細胞未分化狀態的調 節蛋白。這些研究提示，人羊膜組織含有的細胞有望成為再生醫學領域的可 靠細胞來源。

目前的組織工程角膜主要采用去除細胞成分的羊膜作為載體，在其表面 接種角膜緣干細胞來構建，其缺點主要是角膜緣干細胞來源受限，去除細胞 成分的羊膜不能發揮其中羊膜干細胞的作用；同時羊膜結構非常薄，沒有強 度，不能修復角膜缺損，使其臨床應用效果不佳。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種制備組織工程角膜的方 法，所采用的種子細胞具有來源廣泛，增殖、分化能力強的優點；所制備的 角膜無明顯免疫排斥反應，又具有天然角膜的結構和成分，能促進羊膜細胞 的生長、增殖和分化，可用于修復角膜缺損，加速角膜透明。

本發明組織工程角膜的制備方法，其特征在于：是采用羊膜上皮細胞和 羊膜基質細胞作為種子細胞，經體外擴增培養后將其種植在脫細胞天然角膜 基質的兩面，再經體外誘導培養形成組織工程角膜；所述的羊膜上皮細胞和羊 膜基質細胞來自人羊膜，經分離、擴增和體外誘導分化，使羊膜上皮細胞轉化 為角膜上皮細胞，羊膜基質細胞轉化為角膜基質細胞；所述的脫細胞天然角 膜基質來自動物角膜，經削切、脫細胞、脫水處理后所形成的板層角膜支架； 所述的體外誘導培養是采用誘導培養液誘導羊膜細胞分化培養的過程。

本發明所制備的組織工程角膜采用人羊膜細胞為種子細胞，具有來源廣 泛、增殖和分化能力強的優點；作為支架的脫細胞異種角膜基質去除抗原成 分后，顯著降低了免疫排斥反應，又具有天然角膜的結構和成分，能促進羊 膜干細胞的生長、增殖和分化，用于充填角膜缺損，能夠迅速與機體整合實 現透明；最終所形成的組織工程角膜能夠修復角膜缺損。

本發明組織工程角膜的制備方法，具體步驟包括：