[發明專利]一種制備組織工程角膜的方法

有效

• 申請號: 201019018003.7
• 申請日: 2010-02-05
• 公開（公告）號: CN101757690A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 王愛軍
• 申請（專利權）人: 陜西瑞盛生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/36
• 代理公司: 中國科學院西安專利中心 61001
• 代理人: 任越

1.一種制備組織工程角膜的方法，包括有羊膜上皮細胞和羊膜基質細 胞的獲得，其特征在于：是采用羊膜上皮細胞和羊膜基質細胞作為種子細胞， 經體外擴增培養后將其種植在脫細胞天然角膜基質的兩面，再經體外誘導培 養形成組織工程角膜；所述的羊膜上皮細胞和羊膜基質細胞來自人羊膜，經 分離、擴增和體外誘導分化，使羊膜上皮細胞轉化為角膜上皮細胞，羊膜基 質細胞轉化為角膜基質細胞；所述的脫細胞天然角膜基質來自動物角膜，經 削切、脫細胞、脫水處理后所形成的板層角膜支架；所述的體外誘導培養是 采用誘導培養液誘導羊膜細胞分化培養的過程；具體步驟包括：

步驟一、制備角膜支架：取動物角膜剝離去掉角膜周圍組織，PBS溶液 清洗后置于-80℃中冷凍至少30分鐘，于室溫下解凍，如此反復凍融2～5 次；再于4℃純水中浸泡至溶脹后削切至所需厚度；將其置于蛋白酶溶液中 消化，用純水漂洗干凈；再置入0.1～1M的NaOH溶液中浸泡8分鐘以上， 用PBS溶液漂洗至pH中性；將其置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶 液中浸泡25分鐘以上，用PBS溶液漂洗；經脫水干燥后，使用含牛血清、 或膠原蛋白、或多聚賴氨酸、或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的任一種溶液浸泡 20分鐘以上，再經脫水干燥后消毒，得到角膜支架；

步驟二、羊膜細胞的培養：取新鮮人羊膜，分離培養獲得羊膜上皮細胞 和羊膜基質細胞；

步驟三、配制誘導培養液：其組成是在商用EpiLife培養液中添加有， 堿性成纖維細胞生長因子2～20ng/ml、表皮細胞生長因子2～20ng/ml、 轉化生長因子-1為2～30ng/ml、胰島素2～40ng/ml、氫化可的松50～400 ?ng/ml、腺嘌呤20～40μg/ml、轉鐵蛋白1～10μg/ml、前列腺素-E2為0.5～ 8ng/ml、胰島素樣生長因子-1為2～10ng/ml；

步驟四、制備組織工程角膜：在4℃條件下，按質量比將膠原7～10份∶ 透明質酸2～3份∶硫酸軟骨素0.5～1份混合，用0.1～0.5M的醋酸溶液 將其配制成濃度為2～10mg/ml溶液，冰浴下紫外線照射后，按其體積加入 10％的胎牛血清，再加入終濃度為10mg/ml的DMEM培養基，調pH至7.2～ 7.4，制成凝膠溶液；再將所制備角膜支架的基質面浸透凝膠溶液，置于37 ℃環境下預固化；將體外培養的羊膜基質細胞混合于凝膠溶液中，按10⁵～10⁶個/cm²的細胞密度滴加到預固化的角膜支架上，靜置固化后翻轉角膜支架， 將體外培養的羊膜上皮細胞按10⁴～10⁵個/cm²的細胞密度滴加到角膜支架另 一面，靜置2～3小時后，置于培養器皿內的培養支架上，采用誘導培養液連 續培養6～10天，培養期間每天換液，組織工程角膜培養完成。