[發明專利]一種松鼠葡萄球菌脫皮毒素C蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201010623938.0
• 申請日: 2010-12-31
• 公開（公告）號: CN102174553A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 鄭世軍;李海花
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/31;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種松鼠葡萄球菌脫皮毒素C蛋白的制備。

背景技術

松鼠葡萄球菌(Staphylococcus?sciuri)是引起人心內膜炎、腹膜炎、敗血病性休克、尿路感染、盆腔炎和傷口感染的病原。2006年本實驗室從患有滲出性皮炎的豬心包液中分離到一株高致病性松鼠葡萄球菌(Chen?et?al.，2007)。豬滲出性皮炎又稱“豬油皮病”，是一種以皮膚油脂樣滲出、表皮脫落、小水泡形成以及體表痂皮結殼為特征的高度接觸性急性傳染病，除了松鼠葡萄球菌外，常見引起本病的病原還有某些致病性豬葡萄球菌(S.hyicus)。據報道，目前已發現了6種脫皮毒素，ExhA、ExhB、ExhC、ExhD、ShetA和ShetB(Devriese?et?al.，1977；Wegener?et?al.，1993)，但針對具體的某一株病原，可能只有一種或幾種脫皮毒素存在。

目前制備脫皮毒素的方法有三種：

1)、利用脫皮毒素是一種分泌型外毒素這一特點，早期研究者通過培養產生脫皮毒素的豬葡萄球菌，收集含有脫皮毒素的培養液上清(Amesberg，1979；Sato?et?al.，1991；Wegener?et?al.，1993)。此法獲得的脫皮毒素混有大量的雜蛋白，并且毒素濃度低不利于后續的研究。

2)、在上述方法的基礎上，研究者又采用飽和硫酸銨沉淀和層析法分離純化豬葡萄球菌培養液上清中的脫皮毒素SHETA和SHETB(Tanabe?et?al.，1993；Sato?et?al.，1999)。該方法步驟繁瑣，首先需要摸索合適的飽和硫酸銨濃度，該濃度既要使脫皮毒素沉淀，又要保護脫皮毒素的活性，然后沉淀下來的蛋白還需要經Sephadex?G-75凝膠層析分段收集洗脫的各個洗脫峰，最后再分析各個洗脫峰中蛋白的脫皮活性。此方法與第一種方法相比，可以獲得較高純度的脫皮毒素，但利用野生型菌株來制備毒素，其生產率低，培養條件苛刻、獲取蛋白的過程繁雜，生產成本高。

3)、利用基因工程技術表達脫皮毒素。該方法操作簡單、成本低廉、可以快速大規模生產目的蛋白，而且蛋白的純度較高。但目前此方法主要應用于豬葡萄球菌脫皮毒素的制備(Ahrens?&?Andresen，2004；Fudaba?et?al.，2005)，對松鼠葡萄球菌脫皮毒素的詳細制備過程卻未見報道。

目前已經證實松鼠葡萄球菌在基因水平存在ExhC部分序列(Chen?et?al.，2007)，但該菌是否產生脫皮毒素、該毒素的致病機制以及我國滲出性皮炎的發生與脫皮毒素的關系目前還未見報道，因此需要制備高純度的松鼠葡萄球菌脫皮毒素C蛋白，一方面可以進行ExhC基礎和臨床的相關研究，另一方面可以作為優良的抗原，通過動物免疫獲得抗ExhC單克隆抗體，有助于ExhC致病機制的研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有生物活性的松鼠葡萄球菌脫皮毒素C蛋白的制備方法。本發明的目的是這樣實現的：

(1)ExhC基因重組質粒的構建

按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取松鼠葡萄球菌基因組(李海花等，2009)。根據GenBank已發表的ExhC全基因核苷酸序列(登陸號：AF515455)設計引物如下：上游引物(ExhC-F)5′-CCGCCATGGCTATGCATTCAAAACTATTAAGTAAAT-3′，下游引物(ExhC-R)5′ATAGCGGCCGCTTTAATTAATTGTTTGAGATCTCTAATGAG-3′，上下游引物分別引入NcoⅠ和NotⅠ酶切位點(下劃線)及相應的保護性堿基。采用PCR的方法擴增ExhC基因全長，經NcoⅠ和NotⅠ酶切后，克隆到pET-28a(+)載體中，同時在ExhC的羧基端引入載體中的6×His標簽，獲得重組質粒pET-28a(+)-ExhC。NcoⅠ和NotⅠ雙酶切初步鑒定陽性克隆，基因測序由諾賽基因公司完成。

(2)ExhC蛋白的獲得