[發(fā)明專利]一種松鼠葡萄球菌脫皮毒素C蛋白的制備方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201010623938.0 | 申請日： | 2010-12-31 |
| 公開（公告）號： | CN102174553A | 公開（公告）日： | 2011-09-07 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 鄭世軍;李海花 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C07K14/31;C07K1/22;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002 | 代理人： | 王加嶺;張慶敏 |
| 地址： | 100193 *** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 松鼠 葡萄球菌 脫皮 毒素 蛋白 制備 方法 | ||
1.一種松鼠葡萄球菌脫皮毒素C蛋白的制備方法，包括如下步驟：
(1)以松鼠葡萄球菌基因組DNA為模板，用SEQ?ID?No.3和SEQID?No.4所示的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增松鼠葡萄球菌脫皮毒素C基因全長，經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ酶切后，克隆到原核表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒；
(2)將重組質(zhì)粒進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定陽性克隆，用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測和Western雜交檢測，證明為松鼠葡萄球菌ExhC特異蛋白，并且篩選能夠穩(wěn)定高效表達(dá)ExhC的克隆株；
(3)提取蛋白粗提液，利用金屬離子親和層析柱純化ExhC蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測證明獲得高純度的ExhC蛋白；
(4)采用尿素變性、梯度透析復(fù)性方法對純化的ExhC蛋白進(jìn)行變性和重折疊獲得具有天然結(jié)構(gòu)的ExhC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述原核表達(dá)載體為pET-28a(+)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述大腸桿菌的菌株為BL21。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述IPTG的終濃度為1mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述金屬離子親和層析柱為鎳離子親和層析柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述篩選能夠穩(wěn)定高效表達(dá)ExhC的克隆株按如下步驟進(jìn)行：挑取多株克隆并進(jìn)行連續(xù)傳代5次后，采用SDS-PAGE方法分析各個克隆的表達(dá)量，最后篩選出能夠穩(wěn)定高效表達(dá)ExhC的克隆株。
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