[發(fā)明專利]渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物總DNA的提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010622765.0
• 申請日: 2010-12-24
• 公開（公告）號: CN102559655A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李長文;李巍;梁慧珍;張長霞;李季;劉冰;閆希軍
• 申請（專利權(quán)）人: 云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京華科聯(lián)合專利事務(wù)所 11130
• 代理人: 王為

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物總DNA的提取和檢測方法，屬于微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

普洱熟茶是以云南特有大葉茶[Camellia?sinensis(Linn)var.assamica(Masters)Kitamura]的曬青毛茶為原料，在微生物的作用下，經(jīng)快速的人工渥堆后發(fā)酵而成的后發(fā)酵茶類。微生物在普洱茶的渥堆發(fā)酵生產(chǎn)過程中起著重要的作用，離開了微生物，普洱茶的品質(zhì)和風(fēng)味將得不到保證，本發(fā)明研究了渥堆發(fā)酵普洱茶中的優(yōu)勢微生物菌群。

目前渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物的研究，主要是應(yīng)用傳統(tǒng)微生物分離、純化、鑒定等方法。傳統(tǒng)的研究方法是首先從特定樣品中取樣，采用模擬自然環(huán)境的各種培養(yǎng)基和條件進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過純培養(yǎng)獲得菌株后，再對其表型特征、細(xì)胞的性質(zhì)(形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)和細(xì)胞組成成分結(jié)構(gòu)的觀察)進(jìn)行觀察收集，同時進(jìn)行一系列繁雜的形態(tài)特征和生理生化實驗，才能對其特性進(jìn)行描述，這種方法又被稱作經(jīng)典方法。

應(yīng)用傳統(tǒng)方法可以分離培養(yǎng)的微生物不一定是優(yōu)勢菌群，只是它們適合并能夠在人工培養(yǎng)條件下被分離純化，不能動態(tài)反映大曲微生物菌群的生長狀態(tài)。在實驗技術(shù)上，普洱茶微生物研究仍停留在細(xì)胞水平，主要研究細(xì)菌、霉菌、酵母和放線菌單一的菌落形態(tài)和純種的生長特性。在實驗結(jié)果上，不能反映分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，不能獲得微生物多樣性的真正概貌。因此傳統(tǒng)的依靠培養(yǎng)的方法制約了人們對微生物生態(tài)的客觀認(rèn)識，對于人們正確認(rèn)識微生物群落結(jié)構(gòu)與功能，正確認(rèn)識微生物資源，正確開發(fā)并利用這些資源造成了嚴(yán)重的障礙。

變性梯度凝膠電泳(DGGE)最初被用于基因的突變檢測，任意位點的單堿基突變的DNA片段和原始的DNA片段能被分開，經(jīng)過序列測定和比較就可以找出突變的位點。變性梯度凝膠電泳對不同DNA片段的分離原理是變性梯度凝膠電泳(DGGE)中同樣長度但具有不同序列的DNA片段能夠被分離，因為在含有呈線形增加梯度變性劑(尿素和甲酞胺)的混合物的聚丙烯酰胺凝膠電泳中部分解鏈的雙鏈DNA分子的電泳遷移率降低。具有不同序列的DNA分子有不同的解鏈行為，將在凝膠的不同位置停止遷移。變性梯度凝膠電泳(DGGE)自1993年以來被用于環(huán)境微生物領(lǐng)域來研究環(huán)境樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)，它是建立在PCR反應(yīng)對環(huán)境樣品中的所有微生物的16S?rRNA(原核生物)和18S?rRNA(真核生物)等保守基因區(qū)間的DNA片斷的擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，這些被擴(kuò)增出的DNA片斷可以代表所有不同微生物的信息，這些使用同一引物對擴(kuò)增出的不同微生物的DNA片斷具有相同的堿基數(shù)，因此一般的電泳無法將它們分離開，這就為后續(xù)的進(jìn)一步研究提出了新的問題。由于變性梯度凝膠電泳(DGGE)可以將不同堿基順序的相同大小的DNA片段予以分離，所以PCR-DGGE可以對環(huán)境樣品中的微生物群落進(jìn)行研究。

然而渥堆發(fā)酵普洱茶與城市污水廠污泥和農(nóng)田土壤的化學(xué)、物理性質(zhì)高度異質(zhì)，微生物數(shù)量和種群分布也明顯不同，這就決定了不同環(huán)境下的樣品在進(jìn)行微生物群落構(gòu)成分析時存在差異。目前國內(nèi)外尚無關(guān)于運用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行渥堆發(fā)酵普洱茶微生物群落構(gòu)成研究的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是公開一種提取渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物總DNA的方法。本發(fā)明根據(jù)普洱茶渥堆發(fā)酵的特性，結(jié)合土壤、污泥樣品微生物DNA提取方法，摸索出一種適用于提取渥堆發(fā)酵普洱茶微生物總DNA的方法。得到的微生物總DNA能全面的包括在普洱茶發(fā)酵過程中的微生物種類，能克服傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)不能得到不可培養(yǎng)微生物的缺陷。

本發(fā)明提供一種從渥堆發(fā)酵普洱茶中提取分離微生物總DNA的方法，該方法包括以下步驟：

1)取不同發(fā)酵過程中的普洱茶樣品；

2)對提取的普洱茶樣品進(jìn)行預(yù)處理；

3)提取預(yù)處理后樣品中微生物的總DNA；

4)將提取的微生物總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；

5)以提取的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增后的總DNA；

其中，步驟1中所述不同發(fā)酵過程為：在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中以每次翻堆為時間點取堆中不同空間位置的茶葉樣品。

步驟2中所述預(yù)處理包括：取茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨得到粉末。

步驟3中所述的提取方法如下：預(yù)處理的樣品，使用Omega?soil?DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，操作步驟根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行。

步驟5中所述的專用引物為：

第一步擴(kuò)增采用的引物為16s1：