[發(fā)明專利]渥堆發(fā)酵普洱茶中微生物總DNA的提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010622765.0
• 申請日: 2010-12-24
• 公開（公告）號: CN102559655A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李長文;李巍;梁慧珍;張長霞;李季;劉冰;閆希軍
• 申請（專利權(quán)）人: 云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京華科聯(lián)合專利事務(wù)所 11130
• 代理人: 王為

1.一種從渥堆發(fā)酵普洱茶中提取分離微生物總DNA的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

1)取不同發(fā)酵過程中的普洱茶樣品；

2)對提取的普洱茶樣品進(jìn)行預(yù)處理；

3)提取預(yù)處理后樣品中微生物的總DNA；

4)將提取的微生物總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；

5)以提取的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增后的總DNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟1中所述不同發(fā)酵過程為：在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中以每次翻堆為時間點取堆中不同空間位置的茶葉樣品。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟2中所述預(yù)處理包括：取茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨得到粉末。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟3中所述的提取方法如下：預(yù)處理的樣品，使用Omega?soil?DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，操作步驟根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟5中所述的專用引物為：第一步擴(kuò)增采用的引物為16s1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和16s2：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，

第二步擴(kuò)增采用的引物為338fGC：

5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和R518：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中PCR反應(yīng)體系為37uLddH2O，5uL?10*反應(yīng)緩沖液，2uL?PCR引物P1，2uLPCR引物P2，2uLdNTP，1uLTaq酶，1uL模板，PCR擴(kuò)增程序為：起始94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，50℃引物復(fù)性45s，72℃引物延伸90s，30個循環(huán)：72℃終延伸10min，得到大曲微生物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，電泳緩沖液為1xTAE緩沖液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟4中所述的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的在于確定總DNA的譜圖，所用方法采用常規(guī)技術(shù)，包括制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠的變性梯度為30％～60％，使用的電泳緩沖液為1xTAE，電壓150V，60℃，電泳8h，sybrgreen染色20min，得瓊脂糖凝膠電泳圖譜，通過該圖可分析比較渥堆發(fā)酵普洱茶微生物種群多樣性程度。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，包括以下步驟：

1)取不同發(fā)酵過程中的普洱茶樣品：在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中以每次翻堆為時間點取堆中不同空間位置的茶葉樣品來測動態(tài)的微生物的群落構(gòu)成；

2)對提取的普洱茶樣品進(jìn)行預(yù)處理：取5g茶葉樣品，使用液氮冷凍研磨3次，轉(zhuǎn)移到2ml離心管中；

3)提取預(yù)處理后樣品中微生物的總DNA：加入200mg玻璃珠，使用Omega?soil?DNA提取試劑盒對處理好的茶葉樣品進(jìn)行提取，加入600ul?SLX溶液，高速振蕩10min混合均勻，70度水浴10min，期間混合樣品數(shù)次，加入200ul?SP2溶液，混合均勻，冰浴5min，13000g離心5min，上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入0.7倍異丙醇，顛倒混勻，13000g離心10min，棄去上清，倒置于吸水紙上干燥，加入200ul?elution?buffer到離心管中，混勻，65度水浴20min溶解DNA，加入50ul?HTR溶液，混合均勻，室溫放置2min，13000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，如果上清依舊帶有深色物質(zhì)重復(fù)加入HTR溶液處理，加入等體積的XP2溶液，充分混合均勻，之后將所有溶液轉(zhuǎn)移到HiBind?DNA柱子中，10000g離心1min，棄去流出液重新使用收集管，加入300ul?XP2溶液，10000g離心1min，棄去流出液和收集管，把柱子放入一個新的收集管中，加入700ul經(jīng)無水乙醇稀釋過的SPW?wash溶液，10000g離心1min，棄去流出液重新使用收集管，再用700ul?SPW?wash溶液洗一次，棄去液體，把柱子插入空的收集管中，13000g離心2min，將柱子放入50度烘箱30min，把柱子放到一個新的離心管中，加入50ul?elution?buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g離心1min，將離心洗脫液重新加入柱子中，65度水浴10min，13000g離心2min，所得洗脫液即為提取好的微生物總DNA；

4)將提取的微生物總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測：以每個樣品5ul的上樣量在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測樣品總DNA，電泳條件為120v，30min；

5)以提取的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增：所用16s引物序列為338f：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，r518：ATTACCGCGGCTGCTGG；所用18s引物序列為GLOL：GCCTGCTTTAAACACTCTA，NS31：TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC，PCR反應(yīng)體系為37uLddH2O，5uL?10*反應(yīng)緩沖液，2uL?PCR引物P1，2uLPCR引物P2，2uLdNTP，1uLTaq酶，1uL模板，PCR擴(kuò)增程序為：起始94℃預(yù)變性4min；94℃變性45s，50℃引物復(fù)性45s，72℃引物延伸90s，30個循環(huán)：72℃終延伸10min；

6)將PCR擴(kuò)增好的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測：以每個樣品5ul的上樣量在1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測PCR擴(kuò)增片段，電泳條件為120v，25min。