[發明專利]一種細胞凍存方法

有效

• 申請號: 201010622260.4
• 申請日: 2010-12-28
• 公開（公告）號: CN102140433A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 林登宇;徐希麗
• 申請（專利權）人: 北京民海生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明涉及組織細胞培養技術領域，具體涉及一種細胞凍存方法。

背景技術

在生物技術飛速發展的今天，我們在生物技術學及其相關科學的研究中，越來越多的運用組織細胞培養繁殖技術，將有研究意義或有應用前景的組織細胞采用低溫度進行長期的保存，一旦有需要，可以隨時對所的細胞進行復蘇，恢復其完整的形態結構與生物學特征，供生命科學研究使用，細胞的凍存方法就顯得特別重要，其凍存的成功與否、質量的好壞是直接影響細胞增殖結果的關鍵因素。

細胞的凍存和復蘇是細胞生物學研究的重要方面之一，其方法各有不同但都遵循慢凍快溶的原理。長期以來，大量國內外細胞生物學相關書籍，介紹的常規細胞凍存方法和人們長期所使用的細胞凍存方法均為：

選取生長成單層的VERO、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17細胞一瓶，其細胞密度約6×10⁴/cm²、培養面積為225cm²，用0.25％質量體積比的胰酶消化2min，棄掉胰酶，加入培養液20ml，吹打混勻細胞懸液，1000rpm離心10min，棄上清，加入常規細胞凍存液20ml混勻，分裝入2ml/管的潔凈凍存管；將凍存管置于2～8℃2h，-20℃2h，-80℃過夜，然后浸入液氮中長期保存。

在長期的生物學實驗中，廣泛使用此方法凍存細胞。大量的實際生物細胞學實驗和統計數據表明，采用這種方法凍存的細胞在復蘇后存活率一般在50～80％，成活率比較低；凍存細胞經復蘇培養后12小時，在普通光學顯微鏡下觀察，存活率一般在65％左右；當存活率小于50％時，細胞生長繁殖緩慢，形態不規則，細胞比較細小，長勢比較差，基本上不能存活；當細胞存活率在70％左右時，細胞分布比較均勻，活細胞比較多，形態比較正常，長滿單層需要4～5天。

發明內容

本發明的目的在于提供一種細胞凍存方法，用以解決現有的凍存細胞存活率較低的問題。

為實現上述目的，本發明提供的細胞凍存方法，包括如下步驟：

將生長成單層的培養細胞用胰酶消化1～8min，棄掉胰酶，按照培養瓶培養面積加入0.08～0.1ml/cm²的細胞凍存液，吹打混勻細胞懸液，分裝入潔凈的凍存管；

將凍存管于2～8℃放置10～40min，然后把凍存管于-80℃放置10～20h，浸入液氮中長期保存。

其中，所述生長成單層的培養細胞優選的細胞密度為5.5×10⁴～6.5×10⁴/cm²。

其中，所述用于消化細胞的胰酶的質量體積比優選為0.15～0.40％，最優選為0.25％。

其中，所述胰酶消化時間優選為2min。

其中，細胞凍存液可為任何本領域公知的細胞凍存液，如由體積百分比為70％的MEM細胞培養液、20％的小牛血清和10％的二甲基亞砜組成的細胞凍存液。

本發明提供的細胞凍存方法可用于凍存任何本領域公知的培養細胞，優選的培養細胞可為VERO、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17細胞。

本發明方法具有如下優點：

本發明方法簡化了細胞凍存的步驟和操作過程，在消化細胞的過程中，去除了常規凍存方法中離心這一步驟，因離心對細胞有一定損傷作用，同時在離心的過程中容易污染細胞；在凍存細胞的過程中，省去了常規凍存方法中-20℃的低溫2小時這一步驟，省去該低溫設備。

本發明方法減少了凍存過程中的污染和對細胞的損壞，降低了工作成本，提高了工作效率，提高了凍存細胞復蘇培養后的成活率，可達90％以上。與常規的細胞凍存方法相比，本發明方法凍存的細胞存活率有明顯的提高，并保證了細胞生長的質量和生物學特性，縮短了細胞復蘇的增殖周期，使復蘇后的組織細胞能及時、保質保量地提供給生物學實驗研究。

具體實施方式

以下實施方式進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。

實施例1