[發明專利]一種萊茵衣藻目標基因敲除方法

無效

• 申請號: 201010620522.3
• 申請日: 2010-12-20
• 公開（公告）號: CN102229940A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 鄧曉東;費小雯
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66
• 代理公司: 海口翔翔專利事務有限公司 46001
• 代理人: 莫臻

技術領域

本發明屬生物工程技術領域，具體涉及一種利用中間載體可以快速、準確高效針對萊茵衣藻目標基因進行沉默的敲除方法。

背景技術

萊茵衣藻屬于綠藻門、團藻目、衣藻科，是一種單細胞真核鞭毛藻類，是研究多種生命活動(如光合作用、鞭毛組裝、趨光性、細胞周期的調控與細胞識別等)的模式生物，與酵母細胞有許多共同的特征，如生長周期簡單，生長快，世代時間短，可以在平板上形成單克隆，也能進行液體培養，以單倍體與二倍體兩種形式生長，能對其配子的發育過程進行四分子分析等。因此有“光合酵母”之稱。它遺傳背景清楚，是目前唯一建立細胞核、葉綠體和線粒體三套遺傳轉化系統的生物材料。

萊茵衣藻作為植物和動物的共同祖先，其基因組可以為多細胞生物的進化提供重要的信息。萊茵衣藻大約有15000個基因，通過萊茵衣藻基因組計劃，科學家們得到了萊茵衣藻基因組的95％的序列。將萊茵衣藻基因組與其它已知的基因組比較發現，萊茵衣藻和人類共有45％的基因，和開花植物共有62％的基因。這說明對萊茵衣藻的研究具有普遍的意義。

萊茵衣藻結構基因組學以及表達序列標簽計劃的完成為萊茵衣藻的反向遺傳學的研究提供了可能。RNA干擾作為功能基因組學研究的有力工具，已經在真菌、植物、果蠅、低等脊椎動物及哺乳動物的研究中大量應用并取得了顯著成效。RNA干擾(RNA?interference，RNAi)現象是指內源性或外源性雙鏈RNA(double?strand?RNA，dsRNA)介導的細胞內mRNA發生特異性降解，最終導致相應的轉錄后基因沉默。其快速簡便、通用性強、靶向性高等特點在基因功能鑒定的研究中顯示出了很強的優越性。RNA干擾最早是在線蟲中發現的一種由雙鏈RNA引發的基因沉默現象，后來的研究證實不論是長的雙鏈RNA(dsRNA)或小發夾RNA(small?hairpin?RNA，shRNA)，最后都要被Dicer加工成21個堿基長度的功能性雙鏈小RNA——siRNA(small?interfering?RNA)。siRNA在細胞質內與包括Argonaute在內的相關蛋白質因子結合形成RISC復合體，通過堿基配對識別靶標RNA，在鎂離子和ATP的參與下，Argonaute蛋白利用其核酸內切酶活性切割與之完全互補配對的靶標RNA，產生具有5’磷酸基和3’羥基末端的mRNA片段，使之更易受到5’或3’核酸外切酶的攻擊而快速降解。這種機制即是通常所說的RNA干擾。然而就萊茵衣藻來講，通過RNAi技術對候選基因的敲除還只是處于起步階段。存在著基因敲出的不穩定性。即在轉RNAi載體的轉基因群體中，一部分通過RNAi效應將目標基因敲出，而另一部分則由于種種原因沒有將目標基因敲出。這對于研究工作十分不利。

發明內容

本發明的目的是提供一種萊茵衣藻目標基因敲除方法，通過篩選對候選基因有沉默效果的轉化子，利用中間載體pMD285自身的酶切位點，通過構建目標基因的反向重復序列來構建目標基因RNAi載體pTSBIR-XIR，從而實現對萊茵衣藻目標基因進行沉默，具有對目標基因敲除效率高、操作簡便、快捷等特點。

本發明所采用的技術原理：

選擇具有致死效應的報告基因：色氨基酸合成酶β亞基(Tryptophan?synthase?β-subunit，TSB)基因。其體內活性和工作原理如下：

色氨基酸合成酶a亞基(TSA)活性：

色氨基酸合成酶β(TSB)亞基活性：

當培養基中添加5-Fluoroindole后：

在克隆色萊茵衣藻色氨基酸合成酶β亞基(TSB)基因的基礎上，將TSB(色氨基酸合成酶β亞基)的反向重復序列和候選基因的反向重復序列串聯在一起，然后置于RbcS-Ble表達框的Ble基因3’非編碼區區域，同時，引入paramaciny抗性的HSP70/RbcS-aphIII表達框，作為轉基因選擇標記。這樣，在轉基因后代群體中，通過檢測色氨基酸合成酶β亞基反向重復序列(TSB-IR)對目標基因的沉默效果(陽性轉化子在含有色氨酸和5-氟吲哚的培養基上可以生長)來篩選對候選基因有沉默效果的轉化子(圖1，目標基因敲除效率達到90％以上)。

通過中間載體pMD285來構建目的基因的反向重復序列具有以下幾個方面的優勢：