[發(fā)明專利]一種萊茵衣藻目標基因敲除方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010620522.3
• 申請日: 2010-12-20
• 公開（公告）號: CN102229940A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發(fā)明（設計）人: 鄧曉東;費小雯
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66
• 代理公司: ?？谙柘鑼＠聞沼邢薰?46001
• 代理人: 莫臻

1.一種萊茵衣藻目標基因敲除方法方法，其特征在于：包括pMCS-SPA-MCS載體和pTSBIR-XIR載體的構建；

1)、中間載體pMD285的構建

以TAKARA公司pMD-18T?Simple載體為基礎，通過設計合成多克隆位點和間隔區(qū)序列，最后插入pMD-18T?Simple載體，得到中間載體pMD285；

A、多克隆位點的設計

選擇實驗室常用的TAKARA公司生產的pMD系列載體T克隆位點兩端的常用內切酶位點作為間隔序列兩端的酶切位點；

B、間隔序列的選取

以在轉基因受體藻株中惰性為原則，選取pCAMBIA1302上的一段180bp在萊茵衣藻基因組中無同源性的一個片段作為間隔序列；

C、兩端帶有多克隆位點間隔序列的合成

將設計好的兩端帶有多克隆位點的間隔序列委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成，所得序列如序列表<400>1；同時，為兩端帶有多克隆位點的間隔序列設計一對引物：

MCSF：5’-CGCAGAATTCTGCAGATATC-3’

MCSR：5’-GGTCGAATTCCAGCACACTG-3’

通過PCR的方法將該序列克隆到pMD-18T?Simple載體上；

D、克隆載體的選取

選取pMD-18T?Simple作為克隆載體；

E、兩端帶有多克隆位點的間隔序列插入pMD-18T?Simple

利用引物

MCSF：5’-CGCAGAATTCTGCAGATATC-3’

MCSR：5’-GGTCGAATTCCAGCACACTG-3’

進行PCR擴增，回收PCR產物并連接pMD-18T?Simple載體，連接產物轉化DH5α細胞，提取質粒則得到pMD285中間載體；

2)、RNAi載體pTSBIR-XIR的構建

A、克隆色萊茵衣藻色氨基酸合成酶β亞基基因3’端非編碼區(qū)450bp的片段；通過引物

TBSF：GCACTGTGCTTTGACAGACAAG；TBSR：CGATTGGTAGCAACAAAGTGAGT

PCR擴增得到TBS基因反向重復序列，分別插入載體SP124S?Ble基因3’端非編碼區(qū)區(qū)域，得到含TBS反向重復序列的中間載體；

B、以SacI/KpnI從pSI103載體上將aphVIII?gene表達框切下，補平，連入步驟1得到的中間載體，得到RNAi載體pTSBIR-XIR。