[發明專利]一種分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法

無效

• 申請號: 201010618840.6
• 申請日: 2010-12-31
• 公開（公告）號: CN102146360A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 李霞;韓鳳;何睿;陳燦玉;焦艷華;梁媛媛;黃志堅;謝恬
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;俞慧

(一)技術領域

本發明涉及一種過氧化物酶的制備技術，具體涉及提取番薯中過氧化物酶的方法。

(二)背景技術

過氧化物酶(Peroxidase，POD)在自然界中分布廣泛，資源豐富，是臨床檢測和診斷的常用標記酶。過氧化物酶與各種抗體的標記物，結合酶聯免疫分析技術(Enzyme-linked?immunosorbent?asssay，ELISA)作為常規手段可用于多種疾病的定位、定量檢測，操作簡便。

辣根過氧化物酶(Horseradish?peroxidase，HR)是迄今為止在酶聯免疫分析中應用最廣泛的標記用酶，但是作為原料需要專門種植辣根，辣根作為非種植植物，原料來源受到限制，相對成本投資提高。

(三)發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一個從番薯皮中提取過氧化物酶的方法，更好地解決材料來源的問題和成本問題并可以獲得高純度高活性的過氧化物酶。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法，包括如下步驟：

(1)番薯清潔后取皮，加入pH?7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，0-15℃均漿抽提，抽提后過濾，得濾液；

(2)取濾液邊攪拌邊加入雙水相萃取劑固體硫酸銨和PEG6000，使硫酸銨的質量百分比濃度為20-30％，PEG6000的質量百分比濃度為6-8％，充分攪拌溶解后，0-15℃靜置分層，取下層溶液即為粗酶液；冷凍干燥后可得到過氧化物酶粗品。

(3)由步驟(2)得到的粗酶液直接經Phenyl?Sepharose6fast?flow疏水層析，上樣后用0-1mol/L的硫酸銨水溶液梯度洗脫，收集呈酶活性的洗脫液后凍干；

(4)步驟(3)所得凍干粉通過下列a或者b的方法處理，得到過氧化物酶制品；

a.凍干粉溶于生理鹽水，經Sepharose?CL-6B凝膠層析，用生理鹽水洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，凍干；凍干粉溶解于pH?7.1-8.5的Tris-HCl緩沖液中，對Tris-HCl緩沖液透析，透析液上樣，經ToYoPEAPL?DEAE-650M離子層析，用0-1mol/L氯化鈉水溶液線性洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，透析，凍干，即為過氧化物酶制品；

b.凍干粉溶解于pH?7.1-8.5的Tris-HCl緩沖液中，對Tris-HCl緩沖液透析，透析液上樣，經ToYoPEAPL?DEAE-650M離子層析，用0-1mol/L氯化鈉水溶液線性洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，凍干；凍干粉溶于生理鹽水，經SepharoseCL-6B凝膠層析，用生理鹽水洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，透析，凍干，即為過氧化物酶制品。

本發明所述步驟(1)中，pH?7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液的體積用量以番薯皮的質量計為5-10mL/g。優選磷酸鹽緩沖液的pH為8.0。

本發明步驟(1)過濾所得濾液，優選進一步進行離心處理，以去除淀粉和小顆粒組織顆粒，取離心上清液進行步驟(2)的處理。所述離心處理優選在0-15℃進行。

本發明所述步驟(2)中，優選加入固體硫酸銨和PEG6000，使硫酸銨的質量百分比濃度為30％，PEG6000的質量百分比濃度為8％。

本發明所述步驟(3)中，優選上樣后依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸銨水溶液分步洗脫。

本發明所述步驟(4)中，所述離子層析中，優選控制Tris-HCl緩沖液的pH為8.3。

進一步，本發明具體推薦所述的方法按照如下步驟進行：

(1)取番薯，清洗，收集番薯皮，先加pH?8.0磷酸鹽緩沖液絞碎，絞碎過程中保持溫度在4℃，然后攪拌均勻后，于4℃浸提，充分浸提后過濾收集濾液，殘渣重復提取，合并濾液；濾液于4℃離心去除淀粉和小顆粒組織顆粒，收集上清液；所述pH?8.0的磷酸鹽緩沖液的體積用量以番薯皮的質量計為5-10mL/g；

(2)取步驟(1)所得上清液，邊攪拌邊加入固體硫酸銨和PEG6000，使硫酸銨的質量百分比濃度為30％，PEG6000的質量百分比濃度為8％，1h內加完，然后靜置，靜置過程中保持溫度在4℃，靜置分層后取下層溶液，即為粗酶液；

(3)粗酶液經Phenyl?Sepharose6fast?flow疏水層析，依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸銨水溶液分步洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，凍干；

(4)步驟(3)所得凍干粉通過下列a或者b的方法處理，得到過氧化物酶制品；