[發明專利]一種分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法

無效

• 申請號: 201010618840.6
• 申請日: 2010-12-31
• 公開（公告）號: CN102146360A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 李霞;韓鳳;何睿;陳燦玉;焦艷華;梁媛媛;黃志堅;謝恬
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;俞慧

1.一種分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法，包括如下步驟：

(1)番薯清潔后取皮，加入pH?7.0-8.0磷酸鹽緩沖液，0-15℃均漿抽提，抽提后過濾，得濾液；

(2)取濾液邊攪拌邊加入雙水相萃取劑固體硫酸銨和PEG6000，使硫酸銨的質量百分比濃度為20-30％，PEG6000的質量百分比濃度為6-8％，充分攪拌溶解后，0-15℃靜置分層，取下層溶液即為粗酶液；

(3)由步驟(2)得到的粗酶液直接經Phenyl?Sepharose6fast?flow疏水層析，上樣后用0-1mol/L的硫酸銨水溶液梯度洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，凍干；

(4)步驟(3)所得凍干粉通過下列a或者b的方法處理，得到過氧化物酶制品；

a.凍干粉溶于生理鹽水，經Sepharose?CL-6B凝膠層析，用生理鹽水洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，凍干；凍干粉溶解于pH?7.1-8.5的Tris-HCl緩沖液中，對Tris-HCl緩沖液透析，透析液上樣，經ToYoPEAPL?DEAE-650M離子層析，用0-1mol/L氯化鈉水溶液線性洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，透析，凍干，即為過氧化物酶制品；

b.凍干粉溶解于pH?7.1-8.5的Tris-HCl緩沖液中，對Tris-HCl緩沖液透析，透析液上樣，經ToYoPEAPL?DEAE-650M離子層析，用0-1mol/L氯化鈉水溶液線性洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，凍干；凍干粉溶于生理鹽水，經SepharoseCL-6B凝膠層析，用生理鹽水洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，透析，凍干，即為過氧化物酶制品。

2.如權利要求1所述的分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法，其特征在于所述步驟(1)中，pH?7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液的體積用量以番薯皮的質量計為5-10∶1。

3.如權利要求1所述的分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法，其特征在于所述步驟(1)中，使用的磷酸鹽緩沖液的pH為8.0。

4.如權利要求1所述的分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所得濾液進行離心處理，取離心上清液進行步驟(2)的處理，所述離心處理在0-15℃進行。

5.如權利要求1所述的分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中，加入固體硫酸銨和PEG6000，使硫酸銨的質量百分比濃度為30％，PEG6000的質量百分比濃度為8％。

6.如權利要求1所述的分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法，其特征在于所述步驟(3)中，上樣后依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸銨水溶液分步洗脫。

7.如權利要求1所述的分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法，其特征在于所述步驟(4)中，所述離子層析中使用的Tris-HCl緩沖液的pH為8.3。

8.如權利要求1所述的分離提取番薯皮中過氧化物酶的方法，其特征在于所述的方法具體按照如下步驟進行：

(1)取番薯，清洗，收集番薯皮，先加pH?8.0磷酸鹽緩沖液絞碎，絞碎過程中保持溫度在4℃，然后攪拌均勻后，于4℃浸提，充分浸提后過濾收集濾液，殘渣重復提取，合并濾液；濾液于4℃離心去除淀粉和小顆粒組織顆粒，收集上清液；所述pH?8.0的磷酸鹽緩沖液的體積用量以番薯皮的質量計為5-10mL/g；

(2)取步驟(1)所得上清液，邊攪拌邊加入固體硫酸銨和PEG6000，使硫酸銨的質量百分比濃度為30％，PEG6000的質量百分比濃度為8％，1h內加完，然后靜置，靜置過程中保持溫度在4℃，靜置分層后取下層溶液，即為粗酶液；

(3)粗酶液經Phenyl?Sepharose6fast?flow疏水層析，依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸銨分步洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，凍干；

(4)步驟(3)所得凍干粉通過下列a或者b的方法處理，得到過氧化物酶制品；

a.凍干粉溶于生理鹽水，經Sepharose?CL-6B凝膠層析，用生理鹽水洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，凍干；凍干粉溶解于pH?8.3的Tris-HCl緩沖液中，對Tris-HCl緩沖液透析，透析液上樣，經ToYoPEAPL?DEAE-650M離子層析，用0-1mol/L氯化鈉水溶液線性洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，透析，凍干，即為過氧化物酶制品；

b.凍干粉溶解于pH?8.3的Tris-HCl緩沖液中，對Tris-HCl緩沖液透析，透析液上樣，經ToYoPEAPL?DEAE-650M離子層析，用0-1mol/L氯化鈉水溶液線性洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，凍干；凍干粉溶于生理鹽水，經SepharoseCL-6B凝膠層析，用生理鹽水洗脫，收集呈酶活性的洗脫液，透析，凍干，即為過氧化物酶制品。