[發明專利]羅漢果甜苷V半抗原和人工抗原及其制備方法

無效

• 申請號: 201010617287.4
• 申請日: 2010-12-31
• 公開（公告）號: CN102153612A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 段小群;楊新平;李勇文;李麗;盧曦;陳旭;李芳耀;林家遜
• 申請（專利權）人: 桂林醫學院
• 主分類號: C07J17/00
• 分類號: C07J17/00;C07K14/765;C07K1/113
• 代理公司: 桂林市華杰專利商標事務所有限責任公司 45112
• 代理人: 羅玉榮

技術領域

本發明涉及免疫學技術領域，具體是羅漢果甜苷V半抗原和人工抗原及其制備方法。

背景技術

免疫分析是一種基于抗原抗體特異性識別和結合反應的分析方法，不僅可用于測定蛋白質、酶等大分子物質，而且還廣泛用于測定小分子量的藥物，特別適用于那些色譜法難以分析的藥物。免疫分析不僅為臨床診斷提供了依據，在內分泌學、病毒學、藥理學、血液學及腫瘤學等研究方面得以應用，而且在農業科學、食品科學、環境保護、生態學及法醫學等領域的應用也有所進展。免疫分析具有檢測靈敏度高、特異性強、前處理簡單、反應速度快、檢測費用低廉，適于現場監控和大批量樣品分析的特點。

羅漢果甜甙V為葫蘆素烷三萜類化合物是羅漢果的主要有效成分,在羅漢果干果中的總含量為3.755%-3.858%。羅漢果甜苷V在醫藥領域與食品工業方面運用非常廣泛，其社會需求呈逐年上升趨勢。羅漢果甜苷V為小分子天然化合物，相對分子質量較小，僅具有反應原性，而不具有免疫原性，因此不能直接采用免疫方法檢測，需要與大分子蛋白等偶聯形成復合物后才能成為完全抗原。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種羅漢果甜苷V的半抗原和人工抗原；

本發明的另一個目的是要提供上述羅漢果甜苷V的半抗原和人工抗原的制備方法，所制備出的產品可用于誘導生成抗羅漢果甜苷V特異性抗體的免疫方法研究，可用于羅漢果甜苷V特異性抗體效價的檢測，其制備方法合成步驟簡單，條件溫和，產率較高。

本發明的目的通過如下技術方案來實現：

一種羅漢果甜苷V半抗原和人工抗原的制備方法，以羅漢果甜苷V為原料，利用丁二酸酐與羅漢果甜苷V反應生成羅漢果甜苷V丁二酸單酯(羅漢果甜苷V-HS)，得到羅漢果甜苷V人工半抗原，用紅外光譜和紫外光譜確定半抗原的結構；人工半抗原不分離，在堿性條件下，使之分別與牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HAS)結合，制得羅漢果甜苷V人工抗原羅漢果甜苷V-HS-BSA復合物和羅漢果甜苷V-HS-HAS復合物，用紅外光譜和紫外光譜鑒定羅漢果甜苷V人工抗原，測定其結合比；其反應方程式為：

（1）羅漢果甜甙V-HS人工半抗原

（2）羅漢果甜苷V-HS-BSA人工抗原

羅漢果甜苷V-HS???????????牛血清蛋白??????羅漢果甜苷V-HS-BSA人工抗原

（3）羅漢果甜苷V-HS-HSA人工抗原

羅漢果甜苷V-HS????????????人血清蛋白???????羅漢果甜苷V-HS-HSA人工抗原

本發明所述一種羅漢果甜苷V-HS半抗原的制備方法，包括如下步驟：

1）取羅漢果甜苷V、丁二酸酐投入反應瓶中，加入新蒸餾的吡啶，攪拌溶解，加入適量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室溫下反應；

2）用TLC監測反應進度，反應結束，得到反應液；

3）取反應液用氯仿和甲醇制備薄層，得油狀純羅漢果甜苷V-HS半抗原，置于4℃冰箱保存，所述氯仿與甲醇的體積比為V_氯仿∶V_甲醇=1∶1。

本發明所述一種羅漢果甜苷V-HS-BSA人工抗原的制備方法，包括如下步驟：

1）取羅漢果甜苷V、丁二酸酐投入反應瓶中，加入新蒸餾吡啶，攪拌溶解，加入適量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室溫下反應；

2）用TLC監測反應進度，反應結束，得到反應液；

3）?取步驟2）的反應液，不分離，加入適量N,N-二環己基碳二酰亞胺，攪拌反應；

4）攪拌下滴加BSA-碳酸緩沖液，加完后繼續反應，反應中用碳酸緩沖液調pH值為9，于室溫反應5小時；

5）反應液過濾，濾液裝入透析袋，用超純水于4℃透析，每5小時換水一次，透析3天，經冷凍干燥，得偶聯產物為羅漢果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20℃下保存，

步驟4）所述BSA-碳酸緩沖液是將10mgBSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃緩沖液。

本發明所述一種羅漢果甜苷V-HS-HAS人工抗原的制備方法，包括如下步驟：

1）取羅漢果甜苷V、丁二酸酐投入反應瓶中，加入新蒸餾吡啶，攪拌溶解，加入適量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室溫下反應；

2）用TLC監測反應進度，反應結束，得到反應液；