[發(fā)明專利]羅漢果甜苷V半抗原和人工抗原及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010617287.4
• 申請(qǐng)日: 2010-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN102153612A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 段小群;楊新平;李勇文;李麗;盧曦;陳旭;李芳耀;林家遜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 桂林醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C07J17/00
• 分類號(hào): C07J17/00;C07K14/765;C07K1/113
• 代理公司: 桂林市華杰專利商標(biāo)事務(wù)所有限責(zé)任公司 45112
• 代理人: 羅玉榮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是羅漢果甜苷V半抗原和人工抗原及其制備方法。

背景技術(shù)

免疫分析是一種基于抗原抗體特異性識(shí)別和結(jié)合反應(yīng)的分析方法，不僅可用于測定蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)，而且還廣泛用于測定小分子量的藥物，特別適用于那些色譜法難以分析的藥物。免疫分析不僅為臨床診斷提供了依據(jù)，在內(nèi)分泌學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、血液學(xué)及腫瘤學(xué)等研究方面得以應(yīng)用，而且在農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品科學(xué)、環(huán)境保護(hù)、生態(tài)學(xué)及法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用也有所進(jìn)展。免疫分析具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、前處理簡單、反應(yīng)速度快、檢測費(fèi)用低廉，適于現(xiàn)場監(jiān)控和大批量樣品分析的特點(diǎn)。

羅漢果甜甙V為葫蘆素烷三萜類化合物是羅漢果的主要有效成分,在羅漢果干果中的總含量為3.755%-3.858%。羅漢果甜苷V在醫(yī)藥領(lǐng)域與食品工業(yè)方面運(yùn)用非常廣泛，其社會(huì)需求呈逐年上升趨勢。羅漢果甜苷V為小分子天然化合物，相對(duì)分子質(zhì)量較小，僅具有反應(yīng)原性，而不具有免疫原性，因此不能直接采用免疫方法檢測，需要與大分子蛋白等偶聯(lián)形成復(fù)合物后才能成為完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種羅漢果甜苷V的半抗原和人工抗原；

本發(fā)明的另一個(gè)目的是要提供上述羅漢果甜苷V的半抗原和人工抗原的制備方法，所制備出的產(chǎn)品可用于誘導(dǎo)生成抗羅漢果甜苷V特異性抗體的免疫方法研究，可用于羅漢果甜苷V特異性抗體效價(jià)的檢測，其制備方法合成步驟簡單，條件溫和，產(chǎn)率較高。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種羅漢果甜苷V半抗原和人工抗原的制備方法，以羅漢果甜苷V為原料，利用丁二酸酐與羅漢果甜苷V反應(yīng)生成羅漢果甜苷V丁二酸單酯(羅漢果甜苷V-HS)，得到羅漢果甜苷V人工半抗原，用紅外光譜和紫外光譜確定半抗原的結(jié)構(gòu)；人工半抗原不分離，在堿性條件下，使之分別與牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HAS)結(jié)合，制得羅漢果甜苷V人工抗原羅漢果甜苷V-HS-BSA復(fù)合物和羅漢果甜苷V-HS-HAS復(fù)合物，用紅外光譜和紫外光譜鑒定羅漢果甜苷V人工抗原，測定其結(jié)合比；其反應(yīng)方程式為：

（1）羅漢果甜甙V-HS人工半抗原

（2）羅漢果甜苷V-HS-BSA人工抗原

羅漢果甜苷V-HS???????????牛血清蛋白??????羅漢果甜苷V-HS-BSA人工抗原

（3）羅漢果甜苷V-HS-HSA人工抗原

羅漢果甜苷V-HS????????????人血清蛋白???????羅漢果甜苷V-HS-HSA人工抗原

本發(fā)明所述一種羅漢果甜苷V-HS半抗原的制備方法，包括如下步驟：

1）取羅漢果甜苷V、丁二酸酐投入反應(yīng)瓶中，加入新蒸餾的吡啶，攪拌溶解，加入適量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室溫下反應(yīng)；

2）用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)液；

3）取反應(yīng)液用氯仿和甲醇制備薄層，得油狀純羅漢果甜苷V-HS半抗原，置于4℃冰箱保存，所述氯仿與甲醇的體積比為V_氯仿∶V_甲醇=1∶1。

本發(fā)明所述一種羅漢果甜苷V-HS-BSA人工抗原的制備方法，包括如下步驟：

1）取羅漢果甜苷V、丁二酸酐投入反應(yīng)瓶中，加入新蒸餾吡啶，攪拌溶解，加入適量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室溫下反應(yīng)；

2）用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)液；

3）?取步驟2）的反應(yīng)液，不分離，加入適量N,N-二環(huán)己基碳二酰亞胺，攪拌反應(yīng)；

4）攪拌下滴加BSA-碳酸緩沖液，加完后繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)中用碳酸緩沖液調(diào)pH值為9，于室溫反應(yīng)5小時(shí)；

5）反應(yīng)液過濾，濾液裝入透析袋，用超純水于4℃透析，每5小時(shí)換水一次，透析3天，經(jīng)冷凍干燥，得偶聯(lián)產(chǎn)物為羅漢果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20℃下保存，

步驟4）所述BSA-碳酸緩沖液是將10mgBSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃緩沖液。

本發(fā)明所述一種羅漢果甜苷V-HS-HAS人工抗原的制備方法，包括如下步驟：

1）取羅漢果甜苷V、丁二酸酐投入反應(yīng)瓶中，加入新蒸餾吡啶，攪拌溶解，加入適量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于室溫下反應(yīng)；

2）用TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度，反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)液；