[發明專利]一種改進的研究蛋白互作的雙分子熒光互補載體

無效

• 申請號: 201010617212.6
• 申請日: 2010-12-28
• 公開（公告）號: CN102168102A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 王長春;馮采芬;楊莉;宋凱;趙奕銘;王偉;楊玲;俞盼盼;李茶姿;王鋒青
• 申請（專利權）人: 浙江師范大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 杭州賽科專利代理事務所 33230
• 代理人: 陳輝

技術領域

本發明涉及一種載體以及制備該載體的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

蛋白互作是細胞中的一項基本生理作用，發生在所有亞細胞結構及細胞器中的每一個生理過程.闡明蛋白質的相互作用在何時、何地發生以及蛋白質復合物如何形成，能為確定蛋白質生物學作用提供決定性線索。

雙分子熒光互補(bimolecular?fluorescence?complementation，BiFC)是利用熒光蛋白的發光原理研究蛋白互作的一項技術.其主要過程是將熒光蛋白切成N端和C端兩部分，分別與目標蛋白連接，重組載體共轉染細胞.若目標蛋白間存在相互作用，則會牽引熒光蛋白的N端片段與C端片段相互靠近，進而形成熒光蛋白生色團重新發出熒光.因此，在熒光顯微鏡下檢測是否有互補熒光產生，即可推斷出兩目標蛋白是否發生了相互作用(圖1)。與常用的研究蛋白互作的免疫共沉淀、表面等離子共振、酵母雙雜交技術相比，BiFC具有簡單直觀等優點，已成為活細胞內研究蛋白質運動和功能的強有力工具。目前用于BiFC載體構建通常有兩種方法。一種方法是先將熒光基因通過稀有限制性內切酶克隆到中間載體，然后再轉移到雙元表達載體。此方法存在一些不足之處：首先稀有限制性內切酶比較昂貴，而且不容易酶切與連接，這將大大增加研究過程中的難度。其次，先后連接到中間載體、雙元表達載體，此過程比較復雜、繁瑣。另一種方法是采用GATEWAY載體，此方法雖然快速、高效，但所用試劑價格昂貴。因此，采用一種低成本且高效的方法構建所需的載體是極其必要的。

發明內容

鑒于上述原因，本研究提供一種用于研究分子以研究雙分子熒光互補的載體，該載體包括CaMV?35S啟動子和CaMV?35S終止，在CaMV?35S啟動子和CaMV?35S終止子之間包括cEYFP盒或nEYFP盒。

在一個具體的方式中，在cEYFP盒或nEYFP盒前插入有正向的CaMV?35S啟動子，在cEYFP盒或nEYFP盒后插入正向的CaMV?35S終止子。

優選的，該載體包括如下結構；根據權利要求2所述的載體，其特征在于，該載體包括如下結構：EcoRI-XbaI-正向的CaMV?35S啟動子-cEYFP盒或nEYFP盒-SalI-KpnI-BamHI-CaMV?35S終止子。

更優選的，該載體包括如下結構：該載體包括如下結構：EcoRI-XbaI-正向的2個CaMV?35S啟動子-nEYFP盒-SalI-KpnI-BamHI-CaMV?35S終止子；和EcoRI-XbaI-正向的2個CaMV?35S啟動子-cEYFP盒-pstI-SalI-KpnI-BamHI-CaMV?35S終止子-HindIII。

優選的，CaMV?35S終止子的序列包括SQ1；cEYFP盒的序列包括SQ：4；nEYFP盒包括SQ：2。優選的，利用該載體研究蛋白分子之間的互作功能。

另一方面，本發明提供一種構件用于研究雙分子熒光互補的雙元載體的方法，包括：(1)、提供基礎載體pCAMBIA1301，將CaMV35s終止子通過Hind?III/Xba?I插入到pCAMBIA1301的多克隆位點，從而消除了位于Hind?III和Xba?I間的酶切位點，消除的酶切位點為Sal?I、Pst?I和Sph?I；(2)用Xba?I和EcoR?I雙酶切步驟(1)中獲得的pCAMBIA1301-CaMV35s終止子載體，Xba?I單酶切cEYFP盒-pMD18-T或nEYFP盒-pMD18-T，回收上述兩種酶切產物；并將酶切產物進行粘性末端補平；(3)通過cEYFP盒或nEYFP盒連接至補平的pCAMBIA1301-終止子載體中，借此消除了pCAMBIA1301-35s終止子MCS上位于Xba?I和EcoR?I之間的酶切位點，包括BamH?I、Sma?I、Kpn?I、Sac?I、Ban?II等酶切位點，同時也產生了新的Xba?I和EcoR?I酶切位點，挑取正向連接的克隆。這樣產生了單個酶切位點而避免多酶切。在一個優選的方式中，CaMV?35S終止子的序列包括SQ1；cEYFP盒的序列包括SQ；4；nEYFP盒包括SQ：2。