[發明專利]叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法

無效

• 申請號: 201010617136.9
• 申請日: 2010-12-30
• 公開（公告）號: CN102166367A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 唐明;孫學廣;陳輝
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A61L2/18
• 分類號: A61L2/18;A01N47/44;A01P1/00;A01N37/20;A01N43/16;A01N43/80;A61L101/36;A61L101/32;A61L101/48
• 代理公司: 西安集思得知識產權代理有限公司 61210
• 代理人: 張晉吉

技術領域

本發明涉及一種表面消毒方法，具體是一種叢枝菌根真菌孢子的表面消毒方法，屬于微生物培養領域。

背景技術

叢枝菌根真菌(AMF)是一類不能純培養的植物共生菌，在對AMF非共生階段及生理生化的研究中往往需要對其孢子進行表面消毒以排除其他微生物的干擾。由于AMF的孢子具有貼壁的特性，在一般的器具中它們往往貼伏在器壁上，很難使其完全浸沒在消毒液中，從而不能很好的消毒。

目前最為常用的AMF孢子表面消毒方法有：“Kitasato?beaker”法和“Eppendorf?surface?sterilized”法。“Kitasato?beaker”法由英國科學家Mosse在《Transactions?of?the?British?Mycological?Society》1959年42：273-286“ Theregular?germination?of?resting?spores?and?some?observations?on?the?growthrequirements?of?an?End

發明內容

本發明為實現AMF孢子的表面消毒，使消毒過程不致造成孢子的損失同時又不影響孢子的活力，公開了一種AMF孢子的表面消毒方法。

本發明是通過以下技術方法實現的：

a.取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入其中一個培養皿內，裁剪一些吸水紙放入其它幾個培養皿內，另留二個空培養皿不放濾紙與吸水紙，將培養皿包嚴，備用蒸餾水，對培養皿和蒸餾水進行高壓蒸汽滅菌；

b.配制含有氯胺T、氯霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素和吐溫-20共5種試劑的孢子表面消毒液，將消毒液通過微孔濾膜過濾除菌；

c.打開裝有雙層濾紙的培養皿，將載有AMF孢子的濾紙片放入培養皿內的雙層濾紙中間，用膠頭滴管吸取消毒液滴加在上層濾紙上，使整個雙層濾紙浸透并在上層可見消毒液，將培養皿封蓋；

d.消毒過程中如需更換消毒液，可通過轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養皿內吸取消毒液，再轉至另一套空培養皿中重新添加消毒液；

e.在消毒完成后，將雙層濾紙轉移到裝有吸水紙的培養皿中，用吸水紙吸取雙層濾紙所吸附的消毒液；

f.轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的另一培養皿中，用膠頭滴管在上層濾紙中添加無菌水，利用吸水紙吸取水分，重復操作3-5次；

g.取出上層濾紙并倒置放入另一培養皿中，解剖鏡下分別檢查并轉移上層濾紙、下層濾紙和濾紙片上的AMF孢子，AMF孢子的表面消毒完成。

本發明通過雙層濾紙和培養皿的組合實現了對AMF孢子的表面消毒。該方法操作簡單溫和、消毒液用量少，消毒前后不會丟失孢子，也不影響孢子的活力，同時消毒過程中也不需要其他儀器的輔助。

附圖說明

附圖1是本發明AMF孢子表面消毒示意圖。

附圖2是本發明表面消毒后用無菌水清洗AMF孢子的示意圖。

附圖標記為：膠頭滴管1，消毒液2，上層濾紙3，孢子4，濾紙片5，培養皿6，下層濾紙7，無菌水8，吸水紙9。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明做進一步詳細描述：

a.備用10套60mm的玻璃培養皿、直徑為75mm的普通濾紙和吸水紙，取兩張濾紙將其邊緣上折后鋪入培養皿底，其上折的邊緣與培養皿壁留有空隙以便轉移，裁剪一些吸水紙，大小剛好放入培養皿底，4張一組放入培養皿內，共放置7套培養皿，另留二套空培養皿以備轉移雙層濾紙，將培養皿包嚴，備用200ml蒸餾水和2支膠頭滴管，對培養皿、蒸餾水和膠頭滴管在121℃下高壓蒸汽滅菌20min；

b.配制含有50g/L氯胺T、50mg/L氯霉素、100mg/L硫酸慶大霉素、200mg/L硫酸鏈霉素和0.05％吐溫-20的孢子表面消毒液20mL，將消毒液通過0.22μm孔徑的微孔濾膜過濾除菌；

c.整個孢子表面消毒過程在室溫條件下，放置于超凈工作臺上進行，打開裝有雙層濾紙的培養皿，將載有孢子的濾紙片放入培養皿內的兩層濾紙正中，用膠頭滴管吸取消毒液從一側開始滴加在雙層濾紙的上層濾紙上，使整個雙層濾紙浸透并在上層可見消毒液，封蓋培養皿，消毒液滴加過程中避免產生氣泡；

d.消毒過程中如需更換消毒液，可通過轉移雙層濾紙至裝有吸水紙的培養皿內吸走消毒液，再轉至另一套空培養皿中重新添加消毒液來實現；

e.消毒時間為15min，消毒完成后，將雙層濾紙轉移到裝有吸水紙的培養皿中，用吸水紙吸取濾紙吸附的消毒液；