[發(fā)明專利]測定不對稱二甲基精氨酸濃度的方法及診斷試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010615214.1
• 申請日: 2010-12-30
• 公開（公告）號: CN102154444A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋占科;劉希;劉瑤
• 申請（專利權(quán)）人: 北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/527
• 分類號: C12Q1/527;C12Q1/25;C12Q1/34;C12Q1/32
• 代理公司: 北京戈程知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

1.一種測定不對稱二甲基精氨酸濃度的方法，其包括下述步驟：

1)向樣品中加入二甲基精氨酸二甲氨基水解酶，使不對稱二甲基精氨酸和水反應(yīng)產(chǎn)生二甲胺和瓜氨酸，

2)向步驟1)的混合物中加入ATP、天冬氨酸和精氨琥珀酸合成酶，使瓜氨酸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生AMP，

3)向步驟2)的混合物中加入AMP脫氨酶，使AMP和水反應(yīng)產(chǎn)生IMP和氨，

4)向步驟3)的混合物中加入ATP、NAD合成酶和脫氨基氧化型輔酶NAD，使氨發(fā)生反應(yīng)生成氧化型輔酶，

5)通過測定產(chǎn)生的氧化型輔酶NAD的濃度測得不對稱二甲基精氨酸的濃度，

可選地，上述二甲基精氨酸二甲氨基水解酶與ATP、天冬氨酸、精氨琥珀酸合成酶、AMP脫氨酶、NAD合成酶和脫氨基氧化型輔酶NAD分兩批或三批加到樣品中。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定不對稱二甲基精氨酸濃度的方法，其特征在于所述水來源于樣品或額外加入，優(yōu)選地，樣品為血液或尿液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定不對稱二甲基精氨酸濃度的方法，其特征在于測定產(chǎn)生的氧化型輔酶NAD的濃度時(shí)采用電化學(xué)、化學(xué)放光或脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)的方法進(jìn)行，優(yōu)選地，采用通過催化氧化型輔酶NAD為NADH的脫氫酶將氧化型輔酶NAD轉(zhuǎn)化為NADH檢測氧化型輔酶NAD的濃度，優(yōu)選地，所述催化氧化型輔酶NAD為NADH的脫氫酶是葡萄糖脫氫酶或D-3羥丁酸脫氫酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的測定不對稱二甲基精氨酸濃度的方法，其特征在于，當(dāng)通過催化氧化型輔酶NAD為NADH的脫氫酶將氧化型輔酶NAD轉(zhuǎn)化為NADH檢測氧化型輔酶NAD的濃度時(shí)，還包括步驟6)加入黃遞酶和四唑鹽色原，通過檢測生成的甲月替濃度測得氧化型輔酶NAD的濃度，優(yōu)選地，四唑鹽色原選自WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-8、WST-9、WST-10、WST-11、WST-20、WST-21、XTT、INT、TB、NTB、MOPMS或PMS。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的測定不對稱二甲基精氨酸濃度的方法，其特征在于還包括去除樣品中內(nèi)源性瓜氨酸和氨干擾的步驟7)，該步驟在步驟1)之前進(jìn)行，

步驟7)通過向樣品中加入精氨琥珀酸合成酶和AMP脫氨酶使瓜氨酸轉(zhuǎn)化為氨，

然后產(chǎn)生的氨及內(nèi)源性的氨通過下述步驟8)或步驟9)去除，

步驟8)加入谷氨酸、ATP、PK、PEP和谷氨酰胺合成酶，使氨轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺和ADP，ADP和PEP在PK催化下生成ATP和丙酮酸，最后通過加入谷氨酰胺合成酶抑制劑終止反應(yīng)，優(yōu)選地，谷氨酰胺合成酶抑制劑為L-甲硫氨酸黃酰亞胺，或

步驟9)加入谷氨酸脫氫酶、2-酮戊二酸和NADPH，使氨轉(zhuǎn)化為谷氨酸，最后通過加入谷氨酸脫氫酶抑制劑終止反應(yīng)，優(yōu)選地，谷氨酸脫氫酶抑制劑選自p-氯汞苯甲酸吡啶、4-4′-聯(lián)吡啶二硫醚或2，2′-聯(lián)吡啶二硫醚中的一種或者其組合。

6.一種不對稱二甲基精氨酸濃度診斷試劑盒，其包含下述成分：

二甲基精氨酸二甲氨基水解酶????0.1-500kU/L，

ATP???????????????????????????0.5-20mM，

天冬氨酸??????????????????????0.5-20mM，

精氨琥珀酸合成酶??????????????0.1-500kU/L，

NAD合成酶?????????????????????0.1-500kU/L，

AMP脫氨酶?????????????????????0.1-500kU/L，和

脫氨基氧化型輔酶NAD???????????0.5-20mM，

所述試劑盒優(yōu)選為三試劑試劑盒或二試劑試劑盒，其中二甲基精氨酸二甲氨基水解酶與其他成分位于不同的試劑中，優(yōu)選地，精氨琥珀酸合成酶和AMP脫氨酶與其他成分也位于不同的試劑中，其中所述試劑盒為干粉試劑盒或液體試劑盒，優(yōu)選地，當(dāng)所述試劑盒為液體試劑盒時(shí)還包括：

緩沖液????????10-500mM，及

穩(wěn)定劑????????0.01-50％重量體積比，

優(yōu)選地，所述緩沖液為Good′s緩沖液、磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液或乙酸緩沖液，所述穩(wěn)定劑為BSA、EDTA、表面活性劑、甘油或甘露醇。