[發(fā)明專利]測(cè)定不對(duì)稱二甲基精氨酸濃度的方法及診斷試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010615214.1
• 申請(qǐng)日: 2010-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN102154444A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋占科;劉希;劉瑤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/527
• 分類號(hào): C12Q1/527;C12Q1/25;C12Q1/34;C12Q1/32
• 代理公司: 北京戈程知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及測(cè)定不對(duì)稱二甲基精氨酸濃度的方法及診斷試劑盒。特別地，本發(fā)明涉及利用二甲基精氨酸二甲氨基水解酶、ATP、天冬氨酸、精氨琥珀酸合成酶、AMP脫氨酶、NAD合成酶和脫氨基氧化型輔酶NAD生成氧化型輔酶，通過檢測(cè)輔酶濃度測(cè)得不對(duì)稱二甲基精氨酸濃度的方法和試劑盒。

背景技術(shù)

不對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)是一種可在人血和人尿中檢測(cè)到的內(nèi)源性分子，在體內(nèi)甲基化蛋白的水解過程中形成。ADMA可通過抑制一氧化氮合成而發(fā)揮生物學(xué)作用。不斷有新增的臨床研究證明ADMA和重要不良心血管事件或死亡的發(fā)生率之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的及獨(dú)立的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)而推斷出ADMA作為一種重要的新的心血管風(fēng)險(xiǎn)因子。

相對(duì)傳統(tǒng)的心血管風(fēng)險(xiǎn)因子而言，ADMA還可以應(yīng)用在傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子無法解釋異常高冠心病發(fā)病率病例中(例如血透患者)。目前有研究表明ADMA的升高可能在動(dòng)脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病、慢性腎衰、先兆子癇、高同型半胱氨酸血癥、肝臟衰竭、勃起功能障礙等疾病中起著重要的病理生理學(xué)作用。

測(cè)定血清或血漿中不對(duì)稱二甲基精氨酸濃度的方法有很多種，包括高效液相色譜(HPLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及酶法等。

高效液相色譜及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測(cè)，操作復(fù)雜，且需要特殊儀器。CN?101438148A(WO2007103124-A2)利用串聯(lián)質(zhì)譜法，基于ADMA電離后的荷質(zhì)比，在使用已知量的內(nèi)標(biāo)物基礎(chǔ)上測(cè)定樣本中ADMA的含量。WO2006128419-A1指出在使用特殊物質(zhì)除去樣本蛋白后，利用硅酸鹽正相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，同時(shí)添加?13C6-Arginine和D6-ADMA為內(nèi)標(biāo)，可同時(shí)測(cè)定樣本中的精氨酸、ADMA、對(duì)稱二甲基精氨酸(SDMA)。

酶聯(lián)免疫法(ELISA)：目前主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。相對(duì)液相色譜法稍微方便，其缺點(diǎn)在于樣品前處理較繁瑣，大部分操作還需手工操作，耗時(shí)間長，難以實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化。目前已經(jīng)商業(yè)化的ELISA試劑盒(DLD?Diagnostika?GmbH，Germany)分析原理：先使用酰基化試劑將樣本中的ADMA酰基化，然后加入酶標(biāo)板，與結(jié)合在固相上的ADMA競(jìng)爭性結(jié)合ADMA多克隆抗體，采用不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記抗體競(jìng)爭結(jié)合，然后顯色讀出吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同樣步驟操作后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到對(duì)應(yīng)ADMA濃度；CN?1656123A(WO2003102031-A)利用突變的二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)，即在保證突變DDAH對(duì)底物ADMA親和性且不足以水解成二甲胺和瓜氨酸，并由此提出了利用該突變酶特異性結(jié)合ADMA性質(zhì)的酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)、熒光偏振免疫測(cè)定法(FPIA)、放射免疫測(cè)定法(RIA)、克隆酶供體免疫測(cè)定法(CEDIA)等可能的檢測(cè)方法，但是目前市場(chǎng)并沒有發(fā)現(xiàn)其商業(yè)化使用的報(bào)道；US20090053741A指出，基于ADMA與一氧化氮合成酶的多肽片段結(jié)合的特點(diǎn)，提出了一種使用競(jìng)爭性ELISA的檢測(cè)方法。

酶法：基于酶的特異性檢測(cè)，一般重復(fù)性好，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，但目前市場(chǎng)上還沒有成熟產(chǎn)品。WO200046395-A將待測(cè)樣品去蛋白后，使用精氨酸酶去除精氨酸干擾，離子交換柱粗分離ADMA后，使用二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)水解ADMA產(chǎn)生二甲胺和瓜氨酸，進(jìn)而使用比色法測(cè)定瓜氨酸含量，測(cè)定ADMA含量，但是該方法操作相當(dāng)繁瑣，且時(shí)間很長，難以在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣；WO2006030620-A1(JP2006081481，A)利用二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)水解ADMA產(chǎn)生二甲胺和瓜氨酸，按照以下幾種方法測(cè)定：1)二甲胺脫氫酶偶聯(lián)二甲胺和mPMS生成還原型mPMS，還原型mPMS與甲月替(formazan)試劑(NTB或WST-8)反應(yīng)后生成甲月替；2)二甲胺在二甲胺單加氧酶作用下偶聯(lián)NADPH，測(cè)定NADPH的下降反應(yīng)速率；3)瓜氨酸在精氨琥珀酸合成酶作用下生成AMP，而使用熒光素酶(Luciferase)來偶聯(lián)熒光素測(cè)定剩余ATP的含量；4)?瓜氨酸在精氨琥珀酸合成酶作用下生成AMP，偶聯(lián)磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，進(jìn)而在丙酮酸氧化酶作用下來檢測(cè)生成的丙酮酸含量。需要說明的該公開專利并未提到通過AMP脫氨酶來檢測(cè)AMP含量。由于目前現(xiàn)有技術(shù)中還沒有成熟的酶法檢測(cè)ADMA濃度的方法和試劑盒，因此，存在對(duì)能方便、靈敏、準(zhǔn)確地測(cè)定ADMA濃度的方法和試劑盒的需求。

發(fā)明內(nèi)容