[發(fā)明專利]一種應(yīng)用5-氟胞嘧啶實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HIV-1病毒DNA脫胺基化過(guò)程的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010611814.0
• 申請(qǐng)日: 2010-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN102559859A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹春陽(yáng);姚祝軍;魏建科;劉珊珊;藍(lán)文賢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N7/01;C12N15/09;C12R1/93
• 代理公司: 上海海頌知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31258
• 代理人: 何葆芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種監(jiān)測(cè)DNA脫胺基化過(guò)程的方法，具體說(shuō)，是涉及一種應(yīng)用5-氟胞嘧啶實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HIV-1病毒DNA被人源胞嘧啶蛋白脫胺基化過(guò)程的方法。

背景技術(shù)

研究表明：HIV-1病毒通過(guò)其cDNA在人體內(nèi)復(fù)制而感染人體，人體利用自身的免疫功能保護(hù)機(jī)體不受感染；人免疫系統(tǒng)DNA胞嘧啶脫胺基化蛋白APOBEC3G，其在脾臟、睪丸、卵巢、血液的白細(xì)胞如T-淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中大量表達(dá)，該蛋白可以抑制病毒感染因子Vif蛋白缺失的HIV-1病毒感染，具體機(jī)理為：APOBEC3G蛋白可以特異性地脫胺基化HIV-1病毒基因在人體中剛合成的最小cDNA片段5’-CCC-3’中3’端的兩個(gè)胞嘧啶，變?yōu)槟蜞奏ぃ@種脫胺基化修飾可以誘導(dǎo)人體內(nèi)尿嘧啶DNA糖基化酶(全稱：uracil?DNAglycosylase，簡(jiǎn)稱UDG)進(jìn)一步降解病毒DNA最小片段，從而達(dá)到阻止病毒復(fù)制的目的(Nucleic?Acids?Res.2004，32：2421-2429；Nat.Struct.Mol.Biol.2004，11：435-442；Science.2003，300：1112；Cell.2003，113，803-809；Nature.2003，424：99-103；Nature.2003，424：94-98)。因此，研究一種可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA被相應(yīng)蛋白脫胺基化過(guò)程的方法，可為研究脫胺基化蛋白的酶活性提供一種新途徑，尤其是，可為研究抑制HIV-1病毒感染的方法提供一種便捷手段。

但現(xiàn)有研究表明：人源胞嘧啶蛋白脫胺基化的反應(yīng)過(guò)程非常快，不易監(jiān)測(cè)。雖然核磁共振(Nucleic?magnetic?resonance，NMR)技術(shù)是檢測(cè)蛋白質(zhì)與其它分子相互作用最有力最直接的技術(shù)手段之一，且¹H-NMR信號(hào)的靈敏度很高，但氫譜在復(fù)雜的生理?xiàng)l件下不能排除體系中其它分子中原子信號(hào)的干擾，存在信號(hào)重疊和監(jiān)測(cè)不方便等缺陷。

由于¹⁹F-NMR具有接近¹H-NMR信號(hào)靈敏度83％的高靈敏度，能夠在復(fù)雜的生理?xiàng)l件下排除體系中其它分子中原子信號(hào)的干擾。因此，本發(fā)明通過(guò)將19F原子引入到堿基胞嘧啶芳環(huán)的5位，首次提供了一種5-氟胞嘧啶在體外實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HIV-1病毒DNA被人源胞嘧啶蛋白脫胺基化過(guò)程中的應(yīng)用，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種應(yīng)用5-氟胞嘧啶實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HIV-1病毒DNA被人源胞嘧啶蛋白脫胺基化過(guò)程的方法，以克服人源胞嘧啶蛋白脫胺基化病毒基因胞嘧啶的反應(yīng)過(guò)程非常快，不易監(jiān)測(cè)及利用氫譜監(jiān)測(cè)存在信號(hào)重疊和監(jiān)測(cè)不方便等缺陷，為抑制HIV-1病毒感染的研究提供一種便捷手段。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種應(yīng)用5-氟胞嘧啶實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HIV-1病毒DNA脫胺基化過(guò)程的方法，是首先通過(guò)固相合成方法將5-氟胞嘧啶前體引入HIV-1病毒單鏈DNA序列中，合成含有5-氟胞嘧啶的DNA序列，然后將合成的DNA序列與人源胞嘧啶蛋白質(zhì)混合，通過(guò)F譜信號(hào)的變化，監(jiān)測(cè)DNA脫胺基化的反應(yīng)過(guò)程。

所述的5-氟胞嘧啶前體是4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶衍生物；對(duì)于此衍生物，可以參考文獻(xiàn)J.Org.Chem.1992，57，2989-2991中所述的合成方法進(jìn)行制備；也可以通過(guò)如下合成方法得到該化合物：以5-氟尿嘧啶為原料，利用乙酰基保護(hù)羥基，然后在三氯氧磷的作用下與2，4，6-三甲基苯酚作用，得到4位被2，4，6-三甲基苯氧基保護(hù)的5-氟尿嘧啶，然后脫除羥基上乙酰基的保護(hù)，通過(guò)常用的方法將羥基分別和4，4’-二甲氧基三苯基甲基氯及N，N-二異丙基乙胺-2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙亞磷酰胺作用，得到4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶衍生物。

在上述基礎(chǔ)上，應(yīng)用5-氟胞嘧啶實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HIV-1病毒DNA脫胺基化過(guò)程的方法，是首先通過(guò)固相合成方法將4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶衍生物引入HIV-1病毒單鏈DNA的堿基序列中，合成帶有4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶結(jié)構(gòu)的HIV-1病毒DNA，然后將所述的2，4，6-三甲基苯氧基轉(zhuǎn)化為胺基，得到包含兩個(gè)5-氟胞嘧啶的HIV-1病毒DNA；將人源胞嘧啶蛋白與前述得到的包含兩個(gè)5-氟胞嘧啶的HIV-1病毒DNA混合，每1～10分鐘采集一次一維¹⁹F-NMR譜圖，以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HIV-1病毒DNA被人源胞嘧啶蛋白脫胺基化的過(guò)程。