[發明專利]一種應用5-氟胞嘧啶實時監測HIV-1病毒DNA脫胺基化過程的方法

無效

• 申請號: 201010611814.0
• 申請日: 2010-12-29
• 公開（公告）號: CN102559859A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 曹春陽;姚祝軍;魏建科;劉珊珊;藍文賢
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海有機化學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N7/01;C12N15/09;C12R1/93
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙) 31258
• 代理人: 何葆芳

1.一種應用5-氟胞嘧啶實時監測HIV-1病毒DNA脫胺基化過程的方法，其特征在于：是首先通過固相合成方法將5-氟胞嘧啶前體引入HIV-1病毒單鏈DNA序列中，合成含有5-氟胞嘧啶的DNA序列，然后將合成的DNA序列與人源胞嘧啶蛋白質混合，通過F譜信號的變化，監測DNA脫胺基化的反應過程。

2.根據權利要求1所述的應用5-氟胞嘧啶實時監測HIV-1病毒DNA脫胺基化過程的方法，其特征在于：所述的5-氟胞嘧啶前體是4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶衍生物。

3.根據權利要求2所述的應用5-氟胞嘧啶實時監測HIV-1病毒DNA脫胺基化過程的方法，其特征在于：是首先通過固相合成方法將4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶衍生物引入HIV-1病毒單鏈DNA的堿基序列中，合成帶有4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶結構的HIV-1病毒DNA，然后將所述的2，4，6-三甲基苯氧基轉化為胺基，得到包含兩個5-氟胞嘧啶的HIV-1病毒DNA；將人源胞嘧啶蛋白與前述得到的包含兩個5-氟胞嘧啶的HIV-1病毒DNA混合，每1～10分鐘采集一次一維¹⁹F-NMR譜圖，以實時監測HIV-1病毒DNA被人源胞嘧啶蛋白脫胺基化的過程。

4.根據權利要求3所述的應用5-氟胞嘧啶實時監測HIV-1病毒DNA脫胺基化過程的方法，其特征在于：所述的通過固相合成方法合成帶有4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶結構的HIV-1病毒DNA的具體步驟包括：

(1)將HIV-1病毒DNA序列的第一個堿基A的3’末端固定在樹脂上；(2)將HIV-1病毒DNA序列的下一個堿基A的5’-OH用二對甲氧三苯甲基(DMT)保護，堿基上的氨基用苯甲酸保護，然后對3’-OH用氨基磷酸化合物進行活化；(3)將HIV-1病毒DNA序列的第一個堿基A的5’-OH和下一個堿基A的3’-OH形成亞磷酸三酯，然后用碘氧化成磷酸三酯；(4)加入二氯乙酸除去第二個堿基A的5’-OH上的保護劑DMT，循環進行加入下一個堿基的合成，即可最終合成帶有4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶結構的HIV-1病毒DNA。

5.根據權利要求3所述的應用5-氟胞嘧啶實時監測HIV-1病毒DNA脫胺基化過程的方法，其特征在于：將所述的2，4，6-三甲基苯氧基轉化為胺基得到包含兩個5-氟胞嘧啶的HIV-1病毒DNA是采用NH₄OH將2，4，6-三甲基苯氧基轉化為胺基并經HPLC或PAGE純化得到包含兩個5-氟胞嘧啶的HIV-1病毒DNA。

6.根據權利要求3所述的應用5-氟胞嘧啶實時監測HIV-1病毒DNA脫胺基化過程的方法，其特征在于：所述的4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶衍生物是如下結構式的化合物：

7.根據權利要求1所述的應用5-氟胞嘧啶實時監測HIV-1病毒DNA脫胺基化過程的方法，其特征在于：所述的HIV-1病毒單鏈DNA的堿基序列為：5’-TATACCCAAA-3’。

8.根據權利要求1所述的應用5-氟胞嘧啶實時監測HIV-1病毒DNA脫胺基化過程的方法，其特征在于：所述的人源胞嘧啶蛋白為人免疫系統DNA胞嘧啶脫胺基化蛋白-APOBEC3G。