[發明專利]一種快速鑒別棉鈴蟲和煙青蟲的分子生物學方法

有效

• 申請號: 201010609429.2
• 申請日: 2010-12-28
• 公開（公告）號: CN102134599A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 段焰青;李青青;者為;王明鋒;葉靈;王堅;楊麗萍;王文元
• 申請（專利權）人: 紅云紅河煙草（集團）有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 云南協立專利事務所 53108
• 代理人: 旃習涵

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，更具體地說，本發明涉及一種可快速鑒別棉鈴蟲和煙青蟲的分子生物學方法。

背景技術

煙草是我國財政的重要支柱之一，煙青蟲（Helicoverpa?assulta）和棉鈴蟲（H.?armigera）均是煙草生產上的主要害蟲。二者為同域發生近緣種，同屬鱗翅目夜蛾科。二者在形態學、行為學和生態學方面都極其相似，它們的鑒定一直是棉鈴蟲和煙青蟲研究中一個困難的技術瓶頸。而準確的物種鑒定是物種分布調查及種群發生動態研究的前提，也是深入開展生物學、綜合防治等研究的基礎。

傳統的鑒定棉鈴蟲和煙青蟲方法主要依賴于它們的形態特征，但存在較大的局限：(1)近緣種之間的區別特征少且不明顯，傳統方法容易造成錯誤鑒別；(2)用傳統的方法幾乎無法做到鑒定同種害蟲的不同生物型；(3)傳統的鑒定方法難以提供針對兩種害蟲幼蟲或殘缺個體的鑒別。因此，傳統鑒定兩種近緣種的方法不僅費時費力，且常受主觀因素干擾，極易混淆出錯。

二十世紀九十年代，隨著分子生物學的迅速發展，尤其是PCR技術的日趨完善，越來越多的分子生物學技術應用于物種鑒定和分類，但這些研究沒有統一的分子標記，因而適用范圍極為有限。近年來，基于分子鑒定，DNA條形碼應運而生，旨在形成一種快速、精確、可自動化以及全球通用的分類鑒定工具，以滿足不同研究領域和行業對于物種鑒定的迫切需求。

DNA條形碼，也稱DNA條形編碼，類似于超級市場商品包裝上用于識別商品的粗細、間隔不同的黑白條紋圖案，是利用線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（Cytochrome?C?oxidase?I，COI）的前部長約650bp序列作為標記來實現快速、準確和自動化地對物種進行鑒定和分類。DNA條形碼可以檢測物種間及同種個體間的細微差別，為近緣種及種下階元的分類鑒定提供了新的手段，彌補了傳統形態鑒定的諸多不足。但是目前國內外尚無利用DNA條形碼作為分子標記區別鑒定煙青蟲和其近緣種棉鈴蟲的報道。

發明內容

本發明的目的是針對棉鈴蟲和煙青蟲形態鑒定不準確，科學鑒別手段缺乏的不足，提供了一種科學有效、簡便快捷、準確的分子生物學鑒定方法。

本發明的目的通過下述技術方案予以實現。

本發明提供了一種快速鑒別棉鈴蟲和煙青蟲的分子生物學方法，該法包括下述順序的步驟：

（1）?????????????采用標準酚-氯仿法或DNA抽提試劑盒提取棉鈴蟲和煙青蟲總DNA；

（2）?????????????利用DNA條形碼引物COIF:?5'?–ATT?CAA?CCA?ATC?ATA?AAG?ATA?TTG?G-3'?和?COIR:?5'-TAA?ACT?TCT?GGA?TGT?CCA?AAA?AAT?CA-3'進行PCR擴增和測序；

（3）?????????????依據附表1的序列特征變異位點進行物種鑒別。

步驟（1）中，為避免真菌和線蟲的污染，舍去腹部，翅部以及觸角，只從頭、胸以及腿部提取DNA。

步驟（2）中，PCR反應體系為50μl，其中模板DNA約25ng，1×PCR?buffer，2.5mM?Mgcl₂，1mM?dNTP，2?μg/μl?BSA，正、反向引物各2?pM，TaqDNA?聚合酶1個單位。加去離子水調至終體積50μl，以石蠟油封蓋體系。?PCR反應條件如下：95℃預變性3分鐘，94℃?變性1分鐘，50℃?退火1分鐘，72℃延伸1分鐘。35個循環后，72℃再延伸10分鐘。測序反應按廠家建議的條件，使用Applied公司的BigDye?Terminator?kit（V2.0）在ABI?377?自動測序儀（Applied?Biosystems）上電泳測序。

步驟（3）中，依據表1，與棉鈴蟲的序列特征位點一致的為棉鈴蟲，與煙青蟲的序列特征位點一致的為煙青蟲。

與現有技術相比，本發明具有以下突出的優點：

1.本棉鈴蟲和煙青蟲分子生物學鑒別方法能對兩種害蟲不同生物型以及幼蟲或殘缺個體進行鑒定，具有準確、迅速、便捷的特點，通常2天即可完成，相比傳統的形態特征鑒定方法，既可節省時間又可減少費用。

2.?本棉鈴蟲和煙青蟲分子生物學鑒別方法對使用的儀器設備要求較低，比傳統的形態學鑒別更準確可靠。

3.?本棉鈴蟲和煙青蟲分子生物學鑒別方法從根本上解決了當前棉鈴蟲和煙青蟲較難進行準確鑒定的難題，填補了行業空白，具有重要意義。

附表說明