[發明專利]一種檢測人PIK3CA基因突變的方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201010608500.5
• 申請日: 2010-12-28
• 公開（公告）號: CN102533958A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 張泓;姬云;侯青
• 申請（專利權）人: 蘇州科貝生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測人PIK3CA基因突變的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括用于對PIK3CA基因第9號外顯子和第20號外顯子進行基因分型的兩個特異性探針，所述第9號外顯子的特異性探針包含E545K和542K密碼子的核苷酸序列，第20號外顯子的特異性探針包含H1047R密碼子的核苷酸序列，所述PIK3CA第9號外顯子具有SEQ?ID?No：1的連續核苷酸序列；所述PIK3CA第20號外顯子具有SEQ?ID?No：2的連續核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的第9號外顯子的特異性探針為SEQ?ID?No.3，第20號外顯子的特異性探針為SEQ?ID?No.4。

3.根據權利要求1所述的特異性探針3’端經封閉處理、無法延伸。

4.根據權利要求1所述的檢測人PIK3CA試劑盒還包括PCR緩沖液、dNTP、Taq?DNA聚合酶、特異性引物對、SYTO?9熒光染料、水和野生型對照，其中特異性引物選自：

5.根據權利要求1所述的檢測人PIK3CA基因突變的試劑盒，其特征在于每20μl?PCR反應體系終濃度組成為：2μl?PCR緩沖液(10×)、0.6-1.0μl氯化鎂溶液、1.6μl?dNTP、0.1-0.3μl?Taq?DNA聚合酶、100-200nM正向引物和20-40nM反向引物、100-200nM特異性探針，2-5μl?SYTO?9熒光染料，其余為水。

6.一種檢測人PIK3CA基因突變的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)按照常規方法采集待分析的基因組DNA；

2)對上述基因組DNA分別進行PIK3CA基因9和20號外顯子的PCR擴增，再通過Cold-PCR富集擴增產物；反應完成后，將擴增產物再進行變性熔解；

3)根據高分辨率熔解曲線法對擴增后的PIK3CA基因9和20號外顯子進行突變位點檢測。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟2)中PCR擴增的過程為：95℃15分鐘，95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，進行20個循環。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟2)中Cold-PCR富集過程為：82℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，進行15個循環；72℃2分鐘；反應完成后，將擴增產物再進行變復性，90℃30秒，50℃1分鐘。

9.根據權利要求6所述其特征在于，步驟2)中加入的DNA提取液的體積根據提取液中DNA濃度而調整，使加入的DNA量達到10ng。

10.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟3)中，PCR擴增產物樣本在LightCycler?480儀中進行熔解曲線分析，儀器以0.2℃/s的速度從72℃升溫到95℃，獲得樣品的熔解曲線。