[發明專利]一種卵泡刺激素的制備方法

無效

• 申請號: 201010608287.8
• 申請日: 2010-12-21
• 公開（公告）號: CN102464713A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發明（設計）人: 萬龍巖;宣建剛;阮振興;有洪華;陳攀
• 申請（專利權）人: 上海麗珠制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/59
• 分類號: C07K14/59;C07K1/22;C07K1/18
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 郭廣迅

技術領域

本發明涉及一種促性腺激素類藥物的制備方法，具體涉及一種卵泡刺激素的制備方法。

背景技術

卵泡刺激素(FSH)是一種促性腺激素類可注射蛋白質藥物，主要用于女性和男性病人不孕和生殖紊亂的治療。FSH還可用于女性病人輔助生殖技術(ART)中的誘導排卵(OI)和控制性超排卵(COH)。FSH還被用于誘導精子減少的男性病人的精子產生。由于FSH在治療生殖紊亂中的重要性，所以最好提供高純度和高比活性的FSH(參見尿卵泡刺激素標準YBH31242005)。尿卵泡刺激素(u-FSH)是以人絕經期促性腺激素(HMG)為原料，采用現代化生物技術純化而得的。根據尿卵泡刺激素國家標準的記載：“本品為絕經婦女尿中提取的促性腺激素，主要包含卵泡刺激素(Follicle-stimulating?Hormone，簡稱FSH)，幾乎不含黃體生成素(Luteinising?Hormone，簡稱LH)”，表明該產品的主要成分為單組分高純度的FSH，不似其它多組分生化藥物的組成復雜，組成成分不完全明確且含有雜蛋白。

用于生產尿卵泡刺激素的原料HMG主要包含卵泡刺激素與黃體生成素。黃體生成素的效價與卵泡刺激素效價的比值約為1(中國藥典2010年版二部尿促性腺激素，第378頁)。從HMG的電泳分析結果還可以看出，其中還含有大量的雜蛋白。制備高純度尿卵泡刺激素需要除去HMG中的LH和其他尿蛋白質，保留高純度單一活性組分的FSH，獲得成分單一、明確的生化藥品。

目前，國外高純度的u-FSH主要由Serono公司生產，Serono公司的生產方法包括將HMG粗品經乙醇抽提后，再經硅酸鋁吸附，然后采用DEAE柱層析純化，再經抗FSH單克隆抗體層析柱選擇性吸附，最后通過反相層析獲得高純度u-FSH。但是，Serono公司的生產方法存在一個很大的缺陷，即抗FSH單克隆抗體層析需采用氨水進行洗脫，條件劇烈，容易破壞FSH的結構，影響成品的質量和提取效率。

發明內容

因此，本發明的目的是提供一種卵泡刺激素的制備方法，與已有工藝相比，該制備方法獲得的卵泡刺激素純度更高，雜質含量大大降低，更有利于該藥物的臨床應用以及運輸和保存。

本發明提供的卵泡刺激素的制備方法包括以下步驟：

(1)采用二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換層析純化促性腺激素，獲得包含卵泡刺激素的中間體I；

(2)采用黃體生成素單抗親和層析除去中間體I中的黃體生成素，獲得包含卵泡刺激素的中間體II；

(3)采用羧甲基(CM)陽離子交換層析以及Cibacron?Blue染料親和層析進一步純化中間體II，得到卵泡刺激素。

優選地，上述制備方法還包括將步驟(3)得到的卵泡刺激素與輔料，優選為乳糖混合后凍干。其中，優選地，二乙基氨基乙基陰離子交換層析為以二乙基氨基乙基為配基的瓊脂糖陰離子交換柱層析；黃體生成素單抗親和層析為以黃體生成素單抗為配基的瓊脂糖親和柱層析；羧甲基陽離子交換層析為以羧甲基為配基的瓊脂糖陽離子交換柱層析；Cibacron?Blue染料親和層析為以Cibacron?Blue染料為配基的瓊脂糖親和柱層析，每毫升配體含量為大于6.7至7.9微摩爾Cibacron?Blue；顆粒大小為45-165微米。

具體來說，步驟(1)可以包括以下步驟：

a.調節促性腺激素溶液的pH值，使得卵泡刺激素帶負電荷；

b.將促性腺激素溶液加到二乙基氨基乙基瓊脂糖陰離子交換層析柱；

c.以pH值為7.0～7.5的0.03mol/L?Tris-HCl水溶液洗脫；

d.以pH值為7.0～7.5的0.15mol/L?Tris-HCl水溶液洗脫，收集目視可見的條帶。

FSH的等電點在pH?5左右，通過調節pH值可使FSH帶上負電荷，從而被吸附在陰離子交換樹脂上，而一部分尿蛋白雜質因所帶電荷差異而被直接洗出；再將吸附在陰離子交換樹脂上的FSH通過合適的洗脫液洗脫下來，而另一部分雜質由于與層析柱結合得非常牢固被保留在層析柱上。通過DEAE陰離子交換層析進行初步分離可去除＞50％的尿蛋白雜質，得到中間體I。

具體來說，步驟(2)包括以下步驟：

e.將中間體I的溶液加到黃體生成素單抗瓊脂糖親和層析柱；

f.以pH值為7.0～7.5的0.1mol/L?Tris-HCl水溶液洗脫，并檢測洗脫液在280nm處的OD值；