[發明專利]一種基于核酸橫向流試紙條檢測單核苷酸多態性的方法

有效

• 申請號: 201010608280.6
• 申請日: 2010-12-28
• 公開（公告）號: CN102134596A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 毛紅菊;鄒能利;金慶輝;趙建龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海微系統與信息技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術領域

本發明屬單核苷酸多態性的檢測領域，特別是涉及一種基于核酸橫向流試紙條檢測單核苷酸多態性的方法。

背景技術

心血管疾病是現代人的第一大殺手?，F在全球有近四分之一人口為心血管及相關疾病所威脅，而且終其一生，大約有三分之一人的人生為心血管疾病陰影所籠罩，最后有五分之一的人口死于心血管相關疾病。在心血管疾病(如冠心病)的發生、診斷和治療中，KIF6(kinesin-like?protein?6)基因有著重要的影響。KIF6(kinesin-like?protein?6)蛋白是一種與細胞內運輸有關的蛋白質。KIF6基因型提供了傳統風險因素以外的重要信息，以幫助識別冠心病的高?；颊卟⑦M行個性化的治療。KIF6(719?Arg)的單核苷酸多態性(SNP)已被證實可以預測冠心病(CHD)風險的增加，并減少statin(他汀類藥物)治療的事故。這類KIF6基因型攜帶者含有一個或兩個719Arg等位基因(e.g.，Arg/Trp?or?Arg/Arg)，而非攜帶者的基因型缺乏719Arg等位基因(e.g.，Trp/Trp)。并且女性KIF6(719Arg)等位基因攜帶者心梗及冠心病(CHD)危險高于非攜帶者。

目前最常見的單核苷酸多態性檢測方法包括：測序法、單鏈構象多態性檢測(SSCP)、連接或引物延伸法(ligation?or?primer?extension)、基于分子信標的熒光能量共振轉移方法(molecular-beacon-based?fluorescence?resonance?energy?transfer)，電化學檢測(electrochemical?detecting)以及雙色熒光偏振技術等方法。但這些方法普遍存在操作過程復雜，比較費時以及需要貴重的檢測儀器等缺點。因此建立簡單、特異、快速、便捷的靶核酸及單核苷酸多態性檢測方法可以更便于在醫學診斷及臨床檢驗上的推廣使用。

最近許多研究都集中在新的檢測技術的開發以便使PCR及其他擴增技術更適應現代分子診斷的需求。如試紙條檢測技術為生化檢測以及醫學快速檢測提供了便捷的途徑。然而，目前試紙條技術主要是標記了擴增產物或寡核苷酸探針的抗體或鏈親和素試紙條。該試紙條具有一定的優勢，但也因為運用了蛋白的抗原抗體反應，需要更多的標記，并且高親和力的抗體/半抗原對的數量限制了基因多靶標的檢測，增加了成本和步驟，并且更不易于保存。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種基于核酸橫向流試紙條檢測單核苷酸多態性的方法，該方法操作簡單，成本低，具有特異、快速、高分辨、高靈敏度的特點，可應用于臨床醫學中遺傳病、傳染性疾病、腫瘤以及心血管疾病中基因的單核苷酸多態性、基因型的檢測以及不同病原微生物的鑒定。

本發明的一種基于核酸橫向流試紙條檢測單核苷酸多態性的方法，以心血管病相關基因KIF的基因多態性檢測為例進行詳細闡述，包括：

(1)將含有毛細管的膜(Membrane)粘貼在襯墊紙板上，再把吸收區(Absorbent?Pad)放置在含有毛細管的膜之上，重疊1-2mm；再把結合區(Conjugation?Pad)放置在含有毛細管的膜之上，重疊1-2mm；最后把浸入區(Immersion?Pad)放置在結合區之上，重疊1-2mm，得核酸橫向流試紙條；所述含有毛細管的膜上有以捕獲DNA探針包被的兩條檢測線(檢測線1、檢測線2)，和一條質控線；

(2)KIF6?DNA的單核苷酸多態性檢測

取1μL待測樣本，在PCR儀中95℃變性4min，再放入-20℃冰盒退火3min；

首先配制檢測KIF6基因型的反應體系，用于目標DNA與檢測探針的雜交和連接，取水4μL、納米金探針溶液2μL、連接探針Z-KIF-1和Z-KIF-2(濃度為1μM/L)各1μL、TaqDNA連接酶緩沖液1μL和Taq?DNA連接酶(濃度為1個單位)溶液1μL，用移液槍打勻，得混合液；向混合液中加入1μL(濃度為1μM/L)的KIF-1、KIF-2或它們的混合液，用移液槍打勻；然后加入上述處理后的待測樣本，用移液槍打勻，之后再PCR儀中45℃雜交連接30分鐘，再95℃變性4min，再放到-20℃冰盒中退火3min，最后將所得溶液滴加在上述核酸橫向流試紙條的結合區，迅速將試紙條浸入區浸入運行緩沖液(RunningBuffer)中，在液體到達吸收區時平放試紙條，10min后觀察現象。