[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010608280.6
• 申請(qǐng)日: 2010-12-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102134596A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛紅菊;鄒能利;金慶輝;趙建龍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá);謝文凱

1.一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，包括：

(1)將含有毛細(xì)管的膜粘貼在襯墊紙板上，再把吸收區(qū)放置在含有毛細(xì)管的膜之上，重疊1-2mm；再把結(jié)合區(qū)放置在含有毛細(xì)管的膜之上，重疊1-2mm；最后把浸入?yún)^(qū)放置在結(jié)合區(qū)之上，重疊1-2mm，得核酸橫向流試紙條；所述含有毛細(xì)管的膜上有以捕獲DNA探針包被的兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線；

(2)取1μL待測(cè)樣本，在PCR儀中95℃變性4min，再放入-20℃冰盒退火3min；

取水4μL、納米金探針溶液2μL、連接探針Z-KIF-1和Z-KIF-2各1μL、Taq?DNA連接酶緩沖液1μL和濃度為1個(gè)單位的Taq?DNA連接酶1μL，用移液槍打勻，得混合液；向混合液中加入1μL的KIF-1、KIF-2或它們的混合液，用移液槍打勻；然后加入上述處理后的待測(cè)樣本，用移液槍打勻，之后再PCR儀中45℃雜交連接30分鐘，再95℃變性4min，再放到-20℃冰盒中退火3min，最后將所得溶液滴加在上述核酸橫向流試紙條的結(jié)合區(qū)，迅速將試紙條浸入?yún)^(qū)浸入運(yùn)行緩沖液中，在液體到達(dá)吸收區(qū)時(shí)平放試紙條，10min后觀察現(xiàn)象。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于：所述步驟(1)中含有毛細(xì)管的膜的成分為硝酸纖維素膜；結(jié)合區(qū)的成分為聚脂纖維；浸入?yún)^(qū)的成分為玻璃纖維；吸收區(qū)的成分為吸水紙。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于：所述步驟(1)中含有毛細(xì)管的膜上包被的是捕獲DNA探針，其序列為一個(gè)或幾個(gè)通用序列，利用DNA的雜交捕獲檢測(cè)探針上與其互補(bǔ)的通用序列；質(zhì)控線上包被的是質(zhì)控探針Control?Probe，而兩條檢測(cè)線上分別包被了不同的捕獲探針：ZW-T和ZM-T；其中捕獲DNA探針濃度為20μM/L，包被捕獲DNA探針用量為1μL/mm，捕獲探針被溶解在含2％蔗糖和5％甲醇的溶液中。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于：所述捕獲探針ZW-T的序列為5’-TGCGGGTAATCG-TTTTTTTTTTTTTTTT-3’，捕獲探針ZM-T的序列為5’-CAGCATCGTGCG-TTTTTTTTTTTTTTTT-3’，質(zhì)控探針Control?Probe的序列為5‘-AGAGGAGTTGGGACC-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于：所述步驟(2)中待測(cè)樣本的制備：采用裂解法抽提血清樣品中KIF6基因組DNA，然后對(duì)KIF6?DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即得；其中PCR擴(kuò)增體系為：10×緩沖液1.5μl，Taq酶，25mmol/L?MgCl₂?0.8μl、25mmol/L?dNTP?1μl，上下游引物各0.5μl，引物終濃度為0.5pmol/L；擴(kuò)增條件：94℃變性4分鐘；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸4分鐘。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的納米金探針的序列為5’-PO4-GGTCCCAACTCCTCT-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)3-SH-3’；連接探針Z-KIF-1序列為5’-CGATTACCCGCA?ACTCCCAGCATGAAC-3’，連接探針Z-KIF-2的序列為5’-CGCACGATGCTG?ACTCCCAGCATGAAT-3’；Target?DNA?KIF-1的序列為5′-AGAGGAGTTGGGACCGTTCATGCTGGGAGT-3′，TargetDNA?KIF-2的序列為5′-AGAGGAGTTGGGACCATTCATGCTGGGAGT-3′。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的運(yùn)行緩沖液的成分為50mM/L的Tris-HCl，50mM/L的NaCl，2ml/L的Tween-20和0.5g/L的十二烷基硫酸鈉。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的Taq?DNA連接酶緩沖液成分為200mmol/L的Tris-HCl，250mmol/L的KAcO，100mmol/L的MgAcO，10mmol/L的NAD，1％的Triton?X-100，pH7.6@25℃。