[發明專利]一種西瓜果斑病毒金標核酸試紙條及其制備和應用

無效

• 申請號: 201010606747.3
• 申請日: 2010-12-27
• 公開（公告）號: CN102128832A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 匡華;胥傳來;馬文蔚;陳偉;鄧小芳;馬偉;勇倩倩;王利兵
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;C12Q1/68
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種膠體金標記的適配體的金標試紙條檢測西瓜果斑病毒的方法，屬于膠體金檢測技術領域。

背景技術

西瓜、甜瓜病害發生普遍，有些已經得到有效的控制。但是瓜類細菌性果腐病，也稱為果斑病（Bacterial?Fruit?Blotch，簡稱BFB）作為近幾年來呈上升趨勢的一種病害，對瓜類的生產構成了極大威脅。果實發生該病后用藥防治基本上沒有效果，果實腐爛失去商品價值，瓜農損失慘重。由于該病害的主要傳播方式是種子帶菌，所以也給我國的西瓜、甜瓜種殖業和種子出口帶來了嚴重沖擊。

細菌性果腐病的發生已經成為西瓜、甜瓜生產上急需解決的問題之一，怎樣預防、及早發現并進行有效的防治也成為西瓜、甜瓜生產上的首要任務。目前針對該病害，國內外就病原菌的鑒定、檢測技術、帶菌種子的處理等方面作了比較多的研究，但是關于侵染循環等基礎研究仍十分薄弱。

發明內容

本發明的目的是提供膠體金標記的適配體的金標核酸試紙條用于檢測西瓜果斑病毒，該方法具有快速、靈敏度高、操作簡單等優點。

本發明的技術方案：

Aptamer①:3-HS?–AAAAAAAAAAAACGGTAGGGCGAAGAAACCAACACC，

Aptamer②:5-Biotin-TTT?TTT?TTT?TTT?TTT?TTT，

Aptamer③:5-Biotin-?GCCATCCCGCTTCTTTGGTTGTGG，

streptavidin與biotin-Aptamer②反應生成streptavidin-Aptamer?②，streptavidin與Aptamer③反應生成streptavidin-Aptamer③，Aptamer①、Aptamer②、Aptamer③、streptavidin-Aptamer?②、streptavidin-Aptamer③，均購自上海生工生物工程有限公司。

Streptavidin：阿拉丁試劑公司購買

一種西瓜果斑病毒金標核酸試紙條，由下吸水墊1，膠體金偶聯Aptamer①2，streptavidin-?Aptamer②3，streptavidin-?Aptamer?③4，上吸水墊5，硝酸纖維素膜6和底板7所組成；硝酸纖維素膜6固定于底板7上，硝酸纖維素膜6一端與上吸水墊5相聯；而另一端或者與下吸水墊1相聯，或者通過固定于硝酸纖維素膜6一端的膠體金偶聯Aptamer①2與下吸水墊1相連；

膠體金偶聯Aptamer①2、streptavidin-Aptamer②3、streptavidin-?Aptamer?③4間隔地順序復合在硝酸纖維素膜6上；

其中，以streptavidin-Aptamer②3作為檢測帶，以streptavidin-Aptamer?③4作為參照帶；

測試紙寬度不低于3.5?mm，且外觀平整，材料附著牢固，液體移行速度不低于5?mm/min。

所述的西瓜果斑病毒金標核酸試紙條的制備方法：

(1)?biotin修飾的適配體Aptamer②與streptavidin按摩爾比1:4反應生成streptavidin-Aptamer②；

(2)biotin修飾的Aptamer③與streptavidin按摩爾比1:4與反應生成streptavidin-Aptamer?③；

(3)上吸水墊5和下吸水墊1分別貼于底板7上與硝酸纖維素膜6串聯；下吸水墊1或者與固定于硝酸纖維素膜6一端的膠體金偶聯Aptamer①2部分交疊；

(4)?下吸水墊1、膠體金偶聯Aptamer①2及上吸水墊5底面有不干膠紙用于固定于底扳7上。

用所述試紙條檢測西瓜果斑病毒的方法：

(1)樣品制備

西瓜表面病斑處用5%次氯酸鈉溶液消毒后，分別切取病斑周圍和內部尚未有病斑擴展的組織，在無菌水中研碎靜置30min后，用滅菌的接種環蘸取浸泡液在干燥的?YDC培養基平板表面劃線，置于28℃恒溫箱中培養，培養一星期后得到西瓜果斑病毒，刮取培養皿表面西瓜果斑病毒溶于超純水中，即得到待測樣本；

所述YDC培養基為酵母粉葡萄糖氯霉素瓊脂培養基；

(2)操作

將試紙箭頭端浸泡在待測樣本中，不要超過下吸水墊，浸入30s，取出放平，10min讀取結果；

(3)檢測結果

陰性：

檢測帶、參照帶兩條帶都顯色，且檢測帶顏色深于參照帶顏色，說明樣品中不含西瓜果斑病毒；