[發明專利]α-淀粉酶抑制劑產生菌及其篩選方法

有效

• 申請號: 201010605912.3
• 申請日: 2010-12-25
• 公開（公告）號: CN102127508A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 鄭裕國;王遠山;馮志華;薛亞平;王亞軍;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12P19/00;C12R1/045
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

(一)技術領域

本發明別涉及到α-淀粉酶抑制劑產生菌及其篩選方法。

(二)背景技術

糖尿病是一種重大多發性疾病，在世界范圍內普遍存在。由于生活方式的巨大轉變以及人們保健意識的不足，目前我國糖尿病患者已達9240萬人，其中男性5020萬人，女性4220萬人，超過印度，成為世界糖尿病患者最多的國家，發病率(9.7％)僅次于美國(11％)，其中II型糖尿病患者占93.7％。目前常用的治療II型糖尿病藥物有：增加胰島素敏感性的雙胍類——甲福明；促胰島素分泌的磺酰脲類——格列齊特(Gliclazide，商品名唐并康)；α-糖苷酶抑制劑——阿卡波糖、米格列醇(Miglitol，商品名奧恬蘋)、伏格列波糖(Voglibose，商品名倍欣)。其中由于α-糖苷酶抑制劑具有作用溫和持久、毒副作用小甚至無毒的優點，得到越來越多國內外研究者的青睞。

在中國，人們膳食結構中以谷類為主，碳水化合物含量高，餐后血糖水平易升高，而糖苷酶抑制劑可以很好的緩解II型糖尿病患者的癥狀。因此，糖尿病患者對糖苷酶抑制劑類治療藥物有著巨大的需求。α-淀粉酶抑制劑作為這一類物質的代表，備受關注。

α-淀粉酶(α-amylase)為1，4-α-D-葡聚糖水解酶，能夠水解淀粉、?糖原以及相關多糖為寡糖片段。在消化、吸收過程中，食物中的碳水化合物先經唾液α-淀粉酶、胰α-淀粉酶作用分解為寡糖，然后在小腸中經α-葡萄糖苷酶分解為單糖，最后被小腸上皮細胞吸收進入血液循環。α-淀粉酶抑制劑作為一種糖苷水解酶抑制劑，能有效抑制唾液α-淀粉酶和胰α-淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少葡萄糖的產生和攝取，降低血糖和血脂含量水平。在臨床上淀粉酶抑制劑可有效預防與治療糖尿病和高脂血癥。既可單獨使用，也可以與其他降糖藥或降血脂藥聯合使用。臨床醫學上用于防治糖尿病、高血糖、高脂血等癥，如阿卡波糖已成為糖尿病治療的首選藥物。

根據文獻和專利報道，α-淀粉酶抑制劑的篩選是以淀粉酶活性抑制為基礎，測定方法主要包括碘比色法(US3876766)和3，5-二硝基水楊酸(DNS)法(Bernfeld法)。其中碘顯色法屬半定量方法，靈敏度低。3，5-二硝基水楊酸法篩選α-淀粉酶抑制劑基于以下原理：淀粉在胰α-淀粉酶作用下水解產生的還原基團，將3，5-二硝基水楊酸與還原為硝基氨基水楊酸，從而產生顏色變化。通過在波長546nm處測定吸光度(Abs546)可以判斷上述反應的進行。由于α-淀粉酶抑制劑對淀粉水解有抑制作用，可使Abs546值下降，從而可以計算待測物對淀粉酶活性的抑制率。測定時，一般通過調整待測溶液及α-淀粉酶溶液的濃度或用量，使Abs546的值在0.4～0.7范圍內為宜。但該反應中可溶性淀粉與α-淀粉酶對測定系統本底Abs546值的影響接近0.2，對測定區間0.4-0.7而言本底影響較大，而且難以測定抑制劑濃度與酶活的關系。同時該反應顯色需經沸水浴，無法實現在96孔?板上進行，不能利用酶標儀等進行高通量篩選。目前，還沒有高效、靈敏、快速的微生物源α-淀粉酶抑制劑篩選方法報道。

(三)發明內容

本發明目的在于提供一種快速、靈敏的α-淀粉酶抑制劑篩方法。

為達到發明目的本發明采用以下技術方案：

α-淀粉酶抑制劑產生菌，即游動放線菌Actinoplanes?sp.ZJB-08196，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢，武漢大學，保藏編號CCTCC?NO：M?209022，保藏日期2009年2月16日，所述α-淀粉酶抑制劑為阿卡波糖。

本發明所述的α-淀粉酶抑制劑產生菌的篩選方法，其特征在于所述方法為：

(1)待篩選菌株接種到平皿培養基上，20～37℃(優選28℃)培養至長出單菌落，挑選單菌落，接種至斜面培養基上，20～37℃(優選28℃)培養直到菌落長成；所述平皿培養基或斜面培養基的組成為：蔗糖5-30g/L，蛋白胨1-5g/L，酪氨酸0.5-2g/L，K₂HPO₄·3H₂O0.5-2g/L，KCl?0.5-2g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5-2g/L，FeSO₄·7H₂O?0.1-1g/L，瓊脂15-20g/L，溶劑為水，初始pH?6.0-7.5；