[發明專利]α-淀粉酶抑制劑產生菌及其篩選方法

有效

• 申請號: 201010605912.3
• 申請日: 2010-12-25
• 公開（公告）號: CN102127508A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 鄭裕國;王遠山;馮志華;薛亞平;王亞軍;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12P19/00;C12R1/045
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.α-淀粉酶抑制劑產生菌，即游動放線菌Actinoplanes?sp.ZJB-08196，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢，武漢大學，保藏編號CCTCCNO：M?209022，保藏日期2009年2月16日，所述α-淀粉酶抑制劑為阿卡波糖。

2.一種如權利要求1所述的α-淀粉酶抑制劑產生菌的篩選方法，其特征在于所述方法為：

(1)將待篩選菌株接種到平皿培養基上，20～37℃培養至長出單菌落，挑選單菌落，接種至斜面培養基上，20～37℃培養直到菌落長成；所述平皿培養基或斜面培養基的組成為：蔗糖5-30g/l，蛋白胨1-5g/l，酪氨酸0.5-2g/l，K₂HPO₄·3H₂O?0.5-2g/l，KCl?0.5-2g/l，MgSO₄·7H₂O?0.5-2g/l，FeSO₄·7H₂O?0.1-1g/l，瓊脂15-20g/l，溶劑為水，初始pH?6.0-7.5；

(2)挑選步驟(1)得到的菌落接種至發酵培養基中培養，培養溫度25～37℃，搖床轉速150～200rpm，培養1～7天，得到發酵液，取發酵液于4000～12000rpm離心，取上清液備用；所述發酵培養基的組成為：麥芽糖10-120g/l，葡萄糖10-50g/l，黃豆餅粉5-25g/l，碳酸鈣2-10g/l，甘油2-10g/l，谷氨酸鈉2-10g/l，溶劑為水，初始pH6.0-7.5；

(3)將步驟(2)獲得的上清液用水稀釋10-100倍，即為待測樣品，在96板孔內分別加入唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的濃度為0.1U/ml，每1分鐘生成1微摩爾產物CNP所需要的酶量定義為1U，5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麥芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol·L^-1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液90μl，40μl待測樣品；對照組為：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的濃度為0.1U/ml，5mmol/l?2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麥芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol·L^-1磷酸氫二鈉?-檸檬酸緩沖液130μl，用酶標儀于405nm處檢測Abs₄₀₅，每5秒讀一次數，直至Abs₄₀₅不再增加，將Abs₄₀₅相對于對照組降低30％以上的樣品孔標記為陽性菌株，并保存陽性菌株。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述平皿培養基或斜面培養基按以下方法制得：水中加入瓊脂條，邊加熱邊攪拌，直到完全溶解，然后加入蔗糖，蛋白胨，酪氨酸，K₂HPO₄·3H₂O，KCl，MgSO₄·7H₂O，FeSO₄·7H₂O，并攪拌至完全溶解，配制得到終濃度為：蔗糖5-30g/l，蛋白胨1-5g/l，酪氨酸0.5-2g/l，K₂HPO₄·3H₂O?0.5-2g/l，KCl?0.5-2g/l，MgSO₄·7H₂O?0.5-2g/l，FeSO₄·7H₂O?0.1-1g/l，瓊脂15-20g/l的溶液，調節pH?6.0-7.5，121℃滅菌20min，冷卻到60℃，在無菌條件下，倒入無菌的試管中，擺放斜面，冷卻得到斜面培養基；在無菌條件下倒入無菌的平皿中，冷卻得到平皿培養基。

4.一種如權利要求1所述的α-淀粉酶抑制劑產生菌的篩選方法，其特征在于所述方法為：

(1)將待篩選菌株接種到平皿培養基上，28℃培養至長出單菌落，挑選單菌落，接種至斜面培養基上，28℃培養直到菌落長成；所述平皿培養基或斜面培養基的組成為：蔗糖25～30g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸1g/l，K₂HPO₄·3H₂O?0.5～1g/l，KCl?0.5g/l，MgSO₄·7H₂O?0.5g/l，FeSO₄·7H₂O?0.1g/l，瓊脂20g/l，溶劑為水，初始pH?7.0；

(2)挑選步驟(1)得到的菌落接種至發酵培養基中培養，培養溫度28℃，搖床轉速150～200rpm，培養7天，得到發酵液，取發酵液于10000～12000rpm離心，取上清液備用；所述發酵培養基的組成為：麥芽糖40-80g/L，葡萄糖20-40g/L，黃豆餅粉10-15g/L，碳酸鈣5g/L，甘油5g/L，谷氨酸鈉5g/L，溶劑為水，初始pH?7.0；?

(3)將步驟(2)獲得的上清液用水稀釋25-100倍，即為待測樣品，在96板孔內分別加入唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的濃度為0.1U/ml，每1分鐘生成1微摩爾產物CNP所需要的酶量定義為1U，5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麥芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液90μl，40μl待測樣品；對照組為：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的濃度為0.1U/ml，5mmol/l?2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麥芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液130μl，用酶標儀于405nm處檢測Abs₄₀₅，每5秒讀一次數，直至Abs₄₀₅不再增加，將Abs₄₀₅相對于對照組降低30％以上的樣品孔標記為陽性菌株，并保存陽性菌株。?