[發(fā)明專利]一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細(xì)胞核的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010604996.9
• 申請日: 2010-12-25
• 公開（公告）號: CN102127521A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張玉玲;劉鳳軍;翟小偉;陳曉麗;付祥龍;禹學(xué)禮;靳麗軍
• 申請（專利權(quán)）人: 河南科技大學(xué)
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 洛陽公信知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 41120
• 代理人: 苗強

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種去除小鼠卵母細(xì)胞核的方法，具體的說是一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細(xì)胞核的方法。

背景技術(shù)

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，哺乳動物體細(xì)胞核移植技術(shù)作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物、制作乳腺生物反應(yīng)器、治療性克隆等前沿領(lǐng)域的一個不可替代的技術(shù)平臺，雖然在綿羊、牛、豬和小鼠上取得了巨大進(jìn)展，但由于體細(xì)胞核移植的整個技術(shù)體系涉及眾多環(huán)節(jié)，而且各個環(huán)節(jié)效率低下，最終導(dǎo)致體細(xì)胞克隆技術(shù)的總體效率較低，還未超過10％。通過顯微操作構(gòu)建重組胚是核移植研究中普遍采用的經(jīng)典方法，其中卵母細(xì)胞的去核是細(xì)胞核移植中的重要步驟之一，也是能否成功完成核移植的一個重要限制因素，直接關(guān)系到核移植實驗的成敗。一種快速、準(zhǔn)確的去核方法將無疑會提高核移植技術(shù)的整體效率。小鼠作為是最為常用的實驗動物，然而，小鼠卵母細(xì)胞的特性與家畜(牛、羊和豬)差異很大。小鼠卵母細(xì)胞的直徑相對較小，透明帶薄而軟，這種特性使小鼠卵母細(xì)胞在顯微操作去核時難度增大。

傳統(tǒng)的核移植技術(shù)中，主要是通過顯微操作機(jī)械性去除卵母細(xì)胞中的染色質(zhì)而獲得受體胞質(zhì)，但存在耗費時間長、對細(xì)胞損傷大等缺點，而且第1極體與核的相對位置易變動，以致去核率較低。目前，小鼠卵母細(xì)胞去核多借助Piezo裝置，去核率高達(dá)99%，但這種方法需要昂貴的儀器設(shè)備，同時對研究員有很高的技術(shù)要求，大多數(shù)實驗室不易實現(xiàn)。而且，所用針管也不能吸出極體，極體的存在將影響供體細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)體的電融合。另外，還有化學(xué)去核法，透明帶穿孔擠壓去核法，透明帶磨口換平口針兩步去核法等。不同的去核方法有各自的優(yōu)缺點，在操作時間、去核成功率、成本花費及損傷程度上有所不同。兩步法操作步驟繁瑣，耗費時間長，對卵母細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。穿孔擠壓法極易導(dǎo)致細(xì)胞變形，胞質(zhì)散掉。而且有的去核方法技術(shù)要求很高，方法不易掌握，不利推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明主要針對上述問題，而提供一種操作簡便，消耗時間少，對細(xì)胞膜造成的損傷小，成本低廉，去核成功率高的方法。

本發(fā)明為解決上述問題，所采用的技術(shù)方案為：

步驟一：選取基礎(chǔ)酸性臺氏溶液，備用；

步驟二：酸性臺氏溶液的改良：利用濃度為36%的HCl調(diào)節(jié)酸性臺氏溶液的pH值，后用0.22μm的微孔濾器進(jìn)行過濾，于-20℃凍存，備用；

步驟三：損傷微滴制備：在規(guī)格為35mm的塑料皿中，將皿底均等劃分為四個區(qū)域，在每個區(qū)域內(nèi)制作1個30μl的顯微操作液微滴，稱中心微滴；在每個中心微滴外周滴加2個20μl的顯微操作液和1個酸性臺氏溶液微滴，形成周邊微滴，后上面覆蓋一層礦物油；

步驟四：卵母細(xì)胞置于微滴中：取性成熟的小鼠MⅡ期的卵母細(xì)胞置于塑料皿的周邊顯微操作液微滴中，在體視顯微鏡下用吸卵針洗滌5次，放入覆蓋有礦物油的中心微滴，使每個中心微滴中至少含有15個含第1極體的卵母細(xì)胞；

步驟五：調(diào)整顯微操作針：將塑料皿置于倒置相差熒光顯微鏡的顯微操作臺上，將固定管和平口針安裝在顯微操作儀的固定桿上，調(diào)解螺旋，在倒置顯微鏡的視野中，觀察到卵母細(xì)胞、固定管和平口針處于同一水平線的位置；

步驟六：去核：在視野中找到卵母細(xì)胞、固定管和平口針，將卵母細(xì)胞置于固定管前端，利用平口針吸取酸性臺氏溶液，后將平口針移至含有卵母細(xì)胞的中心微滴中，利用平口針調(diào)整第1極體的位置，使平口針的針口位于第1極體透明帶前端，使固定管、卵母細(xì)胞第一極體、平口針針口處于同一水平線位置，吹出平口針管內(nèi)的酸性臺氏溶液與透明帶反應(yīng)，至透明帶變薄變軟，胞質(zhì)向外凸時止，打開顯微鏡的熒光以指示細(xì)胞核位置，回旋平口針注射器，使其產(chǎn)生負(fù)壓，吸出第1極體及其周圍的胞質(zhì)，去核結(jié)束；

步驟七：去核后卵母細(xì)胞活性鑒定：將去過核的卵母細(xì)胞置于0.3%臺盼藍(lán)染色液中，染色3—4分鐘，后用M₂液洗滌4—6次，在體視顯微鏡下查檢染色情況，藍(lán)染者判定為死亡，不著色者判定為存活。

所述的酸性臺氏溶液由NaCl、KCl、CaCl₂·H₂O、MgCl₂·H₂O、葡萄糖、聚乙烯基吡咯烷酮和超純水組成，各成份的重量百分比為NaCl?0.8％、KCl?0.02%?、CaCl₂·H₂O?0.024%?、MgCl₂·H₂O?0.01%、葡萄糖?0.1%、聚乙烯基吡咯烷酮0.4%，余量為超純水。

所述的超純水為去除水中的導(dǎo)電介質(zhì)、不離解的膠體物質(zhì)、氣體及有機(jī)物，其電阻率大于18MΩ*cm。