[發明專利]一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細胞核的方法

無效

• 申請號: 201010604996.9
• 申請日: 2010-12-25
• 公開（公告）號: CN102127521A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 張玉玲;劉鳳軍;翟小偉;陳曉麗;付祥龍;禹學禮;靳麗軍
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 苗強

1.一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細胞核的方法，其特征在于：去核方法為：

步驟一：選取基礎酸性臺氏溶液，備用；

步驟二：酸性臺氏溶液的改良：利用濃度為36%的HCl調節酸性臺氏溶液的pH值，后用0.22μm的微孔濾器進行過濾，于-20℃凍存，備用；

步驟三：損傷微滴制備：在規格為35mm的塑料皿中，將皿底均等劃分為四個區域，在每個區域內制作1個30μl的顯微操作液微滴，稱中心微滴；在每個中心微滴外周滴加2個20μl的顯微操作液和1個酸性臺氏溶液微滴，形成周邊微滴，后上面覆蓋一層礦物油；

步驟四：卵母細胞置于微滴中：取性成熟的小鼠MⅡ期的卵母細胞置于塑料皿的周邊顯微操作液微滴中，在體視顯微鏡下用吸卵針洗滌5次，放入覆蓋有礦物油的中心微滴，使每個中心微滴中至少含有15個含第1極體的卵母細胞；

步驟五：調整顯微操作針：將塑料皿置于倒置相差熒光顯微鏡的顯微操作臺上，將固定管和平口針安裝在顯微操作儀的固定桿上，調解螺旋，在倒置顯微鏡的視野中，觀察到卵母細胞、固定管和平口針處于同一水平線的位置；?

步驟六：去核：在視野中找到卵母細胞、固定管和平口針，將卵母細胞置于固定管前端，利用平口針吸取酸性臺氏溶液，后將平口針移至含有卵母細胞的中心微滴中，利用平口針調整第1極體的位置，使平口針的針口位于第1極體透明帶前端，使固定管、卵母細胞第一極體、平口針針口處于同一水平線位置，吹出平口針管內的酸性臺氏溶液與透明帶反應，至透明帶變薄變軟，胞質向外凸時止，打開顯微鏡的熒光以指示細胞核位置，回旋平口針注射器，使其產生負壓，吸出第1極體及其周圍的胞質，去核結束；

步驟七：去核后卵母細胞活性鑒定：將去過核的卵母細胞置于0.3%臺盼藍染色液中，染色3—4分鐘，后用M₂液洗滌4—6次，在體視顯微鏡下查檢染色情況，藍染者判定為死亡，不著色者判定為存活。

2.根據權利要求1所述的一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細胞核的方法，其特征在于：所述的酸性臺氏溶液由NaCl、KCl、CaCl₂·H₂O、MgCl₂·H₂O、葡萄糖、聚乙烯基吡咯烷酮和超純水組成，各成份的重量百分比為NaCl?0.8％、KCl?0.02%?、CaCl₂·H₂O?0.024%?、MgCl₂·H₂O?0.01%、葡萄糖?0.1%、聚乙烯基吡咯烷酮0.4%，余量為超純水。

3.根據權利要求1所述的一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細胞核的方法，其特征在于：所述的改良后的酸性臺氏溶液的pH值為1.5或2.0。