[發(fā)明專利]一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010604355.3
• 申請(qǐng)日: 2010-12-24
• 公開（公告）號(hào): CN102120761A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王治才;吳建勇;楊學(xué)云;王登峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C07K14/31
• 分類號(hào): C07K14/31;C07K1/107
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯(lián)專利代理事務(wù)所(有限公司) 65107
• 代理人: 王志剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及其制備方法。

背景技術(shù)

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus）是奶牛乳房炎和醫(yī)源性感染的主要病原之一。目前的研究表明，金黃色葡萄球菌有11個(gè)血清型，臨床病例分離的金黃色葡萄球菌多為莢膜多糖5型（type?5?capsular?polysaccharide，CP5）、莢膜多糖8型（type?8?capsular?polysaccharide，CP8）和無莢膜的336型（type?336?polysaccharides，336PS），且不同國家和地區(qū)主要流行血清型不同。Verdier?I（2007年）對(duì)195株醫(yī)源性金黃色葡萄球菌的分型結(jié)果表明，CP5型占42%，CP8型占45%，336型占13%。Melles?D?C（2008年）等對(duì)丹麥分離的162株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌的分型結(jié)果表明，CP5型占28.4%，CP8型占53.7%，336型占17.9%。韓國學(xué)者Han?H?R等（2000年）對(duì)該國奶牛乳房炎分離的107株金黃色葡萄球菌進(jìn)行血清型分型發(fā)現(xiàn)，無莢膜的336PS型占46.7%，CP5和CP8均陽性的菌株為12.1%，CP5/336均陽性菌株為17.8%，CP5/336均陽性菌株為6.5%，未能分型的菌株為4.7%。王登峰等（2010年）對(duì)新疆不同地區(qū)5個(gè)大型奶牛場(chǎng)分離的117株金黃色葡萄球菌分型表明，CP5型占10.36%，CP8型占13.68%，無莢膜的336型占64.96%，未能分型菌株占11.11%。

目前對(duì)金黃色葡萄球菌的感染主要使用抗生素進(jìn)行治療，但由于該菌容易對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致其耐藥性增強(qiáng)，治療效率下降。通過免疫預(yù)防進(jìn)行該病防制已成為研究的熱點(diǎn)。但是，由于金黃色葡萄球菌莢膜多糖（CP5、CP8）和胞外多糖(336PS)無免疫原性，直接使用相應(yīng)的提取物作抗原不能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)。將其分離、純化并與合適的蛋白偶聯(lián)，可作為抗原制備疫苗，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)。

莢膜多糖CP5、CP8的純化和偶聯(lián)研究較多，但無莢膜型的金黃色葡萄球菌胞外多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)與莢膜多糖CP5、CP8完全不同，其純化和偶聯(lián)方法也有所差異。建立一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化和偶聯(lián)技術(shù)方法，將為預(yù)防該型金黃色葡萄球菌疫苗的研制提供技術(shù)支撐。

胞外多糖是金黃色葡萄球菌的主要抗原成分和毒力因子，它具有抗吞噬活性，能阻止中性粒細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬和與相關(guān)抗體的結(jié)合。有關(guān)研究表明，金黃色葡萄球菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)為聚磷酸化核糖醇-N-乙酰葡萄糖胺，與革蘭氏陽性球菌細(xì)胞的主要成分壁磷壁酸類似。該多糖分子量小，免疫原較差，經(jīng)過純化并與合適的載體蛋白偶聯(lián)能夠提高莢膜多糖免疫原性。目前國外已公開的無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖純化和偶聯(lián)方法主要采用是Ali?Ibrahim?Fattom（專利文獻(xiàn)號(hào)US005770208A，US002194151B1；論文：INFECTION?AND?IMMUNITY，Vol.60，No.2，p.584-589）的方法。具體方法為：培養(yǎng)無莢膜型金黃色葡萄球菌至吸光度值20.0（650nm），然后用苯酚-乙醇溶液（體積比1:1）低溫處理2小時(shí)滅活菌體，離心收集沉淀-70℃凍存。懸浮菌體至0.5g/mL，加入溶葡萄球菌酶至終濃度100～150μg/mL，37℃處理3小時(shí)，在加入DNA酶、RNA酶至終濃度50μg/mL，培養(yǎng)4小時(shí)，然后用25%～75%梯度乙醇濃度沉淀多糖。75%乙醇離心收集沉淀，透析凍干。選擇Q?Sepharose柱離子交換層析后，將收集的多糖再經(jīng)溶菌酶的消化殘余的糖肽，再經(jīng)凝膠過濾層析即得到純化多糖。偶聯(lián)試劑選擇的是ADH和EDAC，但反應(yīng)介質(zhì)是在水。用該方法進(jìn)行純化和偶聯(lián)時(shí)，純化過程較為繁雜，偶聯(lián)反應(yīng)體系不穩(wěn)定，不易批量化制備。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：制備一種可為人類或其它動(dòng)物無莢膜型金黃色葡萄球菌感染疫苗研制提供保護(hù)性抗原的技術(shù)方法，利用化學(xué)手段制備無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：所述無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物由無莢膜型金黃色葡萄球菌的胞外多糖在偶聯(lián)試劑作用下與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)制備而成的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。

所述偶聯(lián)試劑是EDAC和Sulfo-NHS或EDAC和ADH。

所述蛋白質(zhì)為牛血清蛋白或卵清蛋白或人血清蛋白或白喉毒素。