[發明專利]一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質偶聯物及其制備方法

無效

• 申請號: 201010604355.3
• 申請日: 2010-12-24
• 公開（公告）號: CN102120761A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 王治才;吳建勇;楊學云;王登峰
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區畜牧科學院獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/31
• 分類號: C07K14/31;C07K1/107
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯專利代理事務所(有限公司) 65107
• 代理人: 王志剛

1.一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質偶聯物，其特征在于：所述的多糖-蛋白質偶聯物由無莢膜型金黃色葡萄球菌的胞外多糖在偶聯試劑作用下與蛋白質共價偶聯制備而成的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質偶聯物。

2.根據權利要求1所述的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌-蛋白質偶聯物，其特征在于：所述偶聯試劑是EDAC和Sulfo-NHS或EDAC和ADH。

3.根據權利要求1所述的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌-蛋白質偶聯物，其特征在于：所述蛋白質為牛血清蛋白或卵清蛋白或人血清蛋白或白喉毒素。

4.根據權利要求1所述的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質偶聯物的制備方法，其特征在于：該制備方法包括以下步驟：

（1）無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化；

（2）用pH值為4.7的100mmol/L?MES緩沖液將純化后的多糖配成10mg/mL的溶液，取1.0mL液體與400μL?EDAC(10mg/mL)和88μL?Sulfo-NHS(6.25mg/mL)溶液混合反應4～6小時后，將反應物在pH值為7.5的1mmol/L?EDTA的0.1mol/L?PBS緩沖液中4℃條件下透析18小時，收集衍生化的多糖中間體溶液；

（3）向衍生化的多糖中間體溶液中加入蛋白質10mg，同時再加入200μL?EDAC(10mg/mL)和44μL?Sulfo-NHS(6.25mg/mL)溶液進行反應12小時，形成多糖-蛋白質偶聯物溶液；

（4）通過凝膠過濾層析法對多糖-蛋白質偶聯物進行純化并收集波峰部分溶液。

5.根據權利要求1所述的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質偶聯物的制備方法，其特征在于：該制備方法包括以下步驟：

（1）無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化；

（2）用pH值為5.6的100mmol/L?MES緩沖液中將純化后的多糖配成10mg/mL的溶液，取1.0mL溶液，加入ADH和EDAC至0.36mol/L、0.015mol/L，反應4～6小時用透析袋（分子截留量為15KDa）4℃透析，去除EDAC和ADH，收集衍生化的多糖中間體溶液；

（3）向衍生化的多糖中間體溶液中加入蛋白質10mg，同時再加入200μL?EDAC(10mg/mL)溶液進行反應18小時，收集多糖-蛋白質偶聯物溶液；

（4）通過凝膠過濾層析法對多糖-蛋白質偶聯物溶液進行層析并收集波峰部分溶液。

6.根據權利要求4或5所述的一種無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖-蛋白質偶聯物的制備方法，其特征在于：所述的無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖的純化包括以下步驟：

（1）將無莢膜型金黃色葡萄球菌菌株接種在含有2%氯化鈉的哥倫比亞液體培養基中，37℃?170轉/分鐘在振蕩培養箱中培養22～24小時，5000轉/分鐘離心收集菌體沉淀；

（2）菌體沉淀用pH值為7.5含2mmol/L硫酸鎂的50mmol/LTris緩沖液懸浮至0.25g/mL加入溶葡萄球菌素至濃度200μg/mL，37℃孵育4小時，12000轉/分鐘離心30分鐘收集上清液；

（3）將上清液用聚乙二醇濃縮至體積的1/5，收集多糖濃縮液；

（4）在多糖濃縮液中加入無水乙醇至總體積的25%～30%，混勻后靜置30分鐘，12000轉/分鐘離心30分鐘后收集上清液；

（5）向上清液中再次加入無水乙醇至總體積的75%，混勻靜置30分鐘后離心12000轉/分鐘收集沉淀，室溫下放置揮發多余的乙醇，留取粗多糖沉淀物；

（6）將粗多糖沉淀物以10mg/mL溶解于緩沖液中，加入DNA酶和RNA酶至濃度0.1mg/mL，37℃振蕩培養箱溫育6小時，再加入蛋白酶ⅩⅣ消化，再次用無水乙醇浸提，獲得粗多糖；

（7）將粗多糖用去離子水溶解，在去離子水中透析48小時；

（8）采用凝膠過濾層析法對粗多糖進行純化，用可見-紫外分光光度計檢測吸光度值（206nm），并繪制曲線，收集波峰部分的液體組分，凍干后獲得純化的無莢膜型金黃色葡萄球菌胞外多糖。