[發明專利]一種可用于外源基因表達的載體及細胞株篩選方法

有效

• 申請號: 201010603674.2
• 申請日: 2010-12-24
• 公開（公告）號: CN102559734A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 謝良志;孫春昀;羅春霞;蓋文琳
• 申請（專利權）人: 神州細胞工程有限公司
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/65;C12N15/113;C12N15/54;C12N15/52;C12Q1/04
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發明領域

本發明涉及生物技術領域，具體的說，本發明涉及采用DNA重組技術在哺乳動物細胞中高效表達的載體，一種將目的基因表達和篩選基因潮霉素B磷酸轉移酶表達緊密連接在一起的技術，一種弱化擴增基因DHFR的表達來提高MTX篩選效率，降低MTX使用濃度的技術。本發明還涉及采用以上技術優化的表達載體轉染細胞后，獲得高水平表達克隆的篩選方法。

發明背景

為了獲得與功能和藥代特性相一致的蛋白翻譯后修飾，生物藥物蛋白需要用哺乳動物細胞來作為其表達宿主細胞。常用的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠腎細胞(CHO)，BHK細胞和雜交瘤NSO細胞等。而CHO細胞由于其可在無血清或無蛋白的培養基中高密度生長，并已證明為安全的生物藥物蛋白生產細胞而被廣泛使用。CHO穩定表達系統已開發了二氫葉酸dhfr擴增系統和谷氨酰胺合成酶GS擴增系統。這兩種系統可獲得高水平的表達，但由于GS系統涉及Lonza公司專利知識產權，高昂的知識產權費使其只能在少數幾個大的制藥公司中應用，CHO-dhfr系統仍是主流的生物藥物蛋白生產細胞株。

異源目的基因需要與一個篩選基因(比如潮霉素B磷酸化轉移酶)一起重組到細胞系基因組上，通過篩選基因的篩選獲得的穩定細胞株可表達目的蛋白。異源目的基因和篩選基因通常放置在相同或不同表達載體上，一個或兩個不同的載體轉染或共轉染細胞后，加入抗生素，比如hygmycin進行篩選，細胞培養數周后，抗生素耐受的生長克隆可檢測目的蛋白的表達水平。由于整合到不同的基因組位置，不同細胞表達目的蛋白的能力差異很大，并且還有大量細胞株只整合了抗生素基因，而沒有整合進入目的基因。因此，為了獲得目的基因整合到高表達位點，通常需要高通量ELISA檢測大量的抗生素耐受克隆來獲得少量的高表達克隆。

基因擴增可使蛋白表達水平得到大幅度的提高而在重組生物蛋白藥物的生產中廣泛使用。以二氫葉酸還原酶(DHFR)為基礎的基因擴增系統廣泛應用于DHFR缺陷型中國倉鼠卵巢細胞系統中。可將目的基因和dhfr篩選基因放置于一個或兩個不同的載體上，轉染細胞后，在不含甘氨酸，次黃嘌呤和胸腺嘧啶的培養基中進行篩選。然后再逐步加入不同濃度的二氫葉酸還原酶抑制劑，甲氨喋呤(MTX)來擴增基因拷貝，提高蛋白的表達能力(Kaufman，R.J.et?al.，JMol?Biol，1982，159，601-621)。高濃度的MTX可擴增基因提高蛋白表達能力，但基因的表達水平也極容易在長期培養中丟失，而使得目的基因的表達量非常不穩定。因此這需要從大量的細胞擴增篩選中，才能獲得極少數的穩定高表達的細胞株，這需要耗費大量的人力和時間。

目前，已有開發了多種商業化的哺乳動物的表達載體，許多優化的載體都主要看重蛋白表達水平的提高，比如采用強病毒啟動子如CMV，SV40來增強目的基因表達的啟動(Barbara?S.C.et?al.，Nucleic?Acids?Research，1991，19(14)，3979-3986；Daniel?J.L.et?al.，Protein?Expression?andPurification，2002，20，500-506)或采用新的NPT篩選系統(KerstinSautter，Wiley?InterScience，2005，530-538)。但優化CHO表達載體更應看重的是：提高效率，降低浪費在低表達或無表達克隆的工作量，提高高蛋白表達克隆的篩選幾率，這樣將可減少制藥的經濟成本和時間成本。Raju?K.K.et?al.，Gene，2001，280，87-95的文章中提到將目的基因定向重組到熱點表達的基因組上，他在載體上放入了5kb的一段基因組轉錄活化區域，與目的基因和dhfr基因共同構建在一個載體上。轉染細胞可明顯的降低篩選工作量和提高基因重組的穩定性。WW?Hong?et?al.，Vaccine，2007，25：4103-11報告的文獻中將CHO表達載體與DHFR?RNAi沉默基因的載體進行共轉染，這個方法能明顯降低dhfr基因的表達水平，在dhfr缺陷型或dhfr正常表達的細胞株中都獲得高表達的細胞系。Brian?K.L.et?al.，Nucleic?Acids?Research，1996，24(9)，1774-1779發表的文獻中，將dhfr基因放置于強啟動子和目的基因之間的內含子內，該結果可明顯減少耐受高濃度的細胞數量，提高耐受克隆的表達量。因此，優化載體來獲得高水平并且穩定表達的細胞株，減少篩選的工作量和工作時間是非常需要的優化方向。

發明內容