[發明專利]一種可用于外源基因表達的載體及細胞株篩選方法

有效

• 申請號: 201010603674.2
• 申請日: 2010-12-24
• 公開（公告）號: CN102559734A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 謝良志;孫春昀;羅春霞;蓋文琳
• 申請（專利權）人: 神州細胞工程有限公司
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/65;C12N15/113;C12N15/54;C12N15/52;C12Q1/04
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1.一種獲得目的蛋白穩定表達的真核細胞表達載體，該載體包含：

a)一個包含強病毒啟動子的目的蛋白表達盒，該表達盒放置于篩選標記的基因內部；

b)一個包含弱病毒啟動子的篩選標記表達盒，該篩選標記基因序列中加入了內含子元件，目的蛋白的表達盒被放置于該內含子元件中；

c)一個包含弱真核細胞啟動子的擴增標記的表達盒。

2.權利要求1所述的表達目的蛋白的表達盒中的強病毒啟動子包含人CMV啟動子部分加上人CMV內含子部分，該強病毒啟動子的序列為SEQ?IDNO：12。

3.權利要求1所述的強病毒啟動子表達盒使IFNγR1受體Fc融合蛋白在未擴增CHO細胞株的平均表達水平達到1～3皮克/細胞/天。

4.權利要求1所述的內含子元件位于篩選標記基因的內部，該載體仍表達出有活性功能的篩選標記，該內含子元件的序列為SEQ?ID?NO：7。

5.權利要求1所述的篩選標記的表達盒使在相同篩選劑濃度下耐受生長的細胞克隆數量明顯減少，表達目的基因的細胞克隆的比例及表達量都明顯偏高。

6.權利要求1所述的篩選標記為潮霉素B磷酸轉移酶，新霉素磷酸轉移酶，黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶或谷氨酰胺合成酶。

7.權利要求1所述的擴增標記表達盒使在較低擴增劑濃度的壓力下基因擴增，抗體的表達量得到迅速增加。

8.權利要求1所述的弱真核細胞啟動子為弱化的人泛醌蛋白啟動子(hUbc)，該啟動子的序列為SEQ?ID?NO：3。

9.權利要求1所述的擴增標記為二氫葉酸還原酶(DHFR)，擴增劑為氨甲喋呤(MTX)。

10.一種目的蛋白穩定表達細胞株的篩選方法，該篩選方法包括：

a)用篩選標記的抗生素篩選獲得的目的蛋白穩定表達的細胞株；

b)用擴增標記的基因擴增篩選獲得的目的蛋白表達水平明顯提高的細胞株。

11.權利要求10所述的蛋白穩定表達細胞株為dhfr基因缺陷型的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。

12.權利要求10所述的篩選標記為潮霉素B磷酸轉移酶時，所使用的篩選劑Hyg的使用濃度為0.4～2.0mg/ml。

13.權利要求10所述的擴增標記物為二氫葉酸還原酶時，所使用的擴增劑MTX的使用濃度為30nM～300nM。

14.一種目的蛋白表達方法，該方法包含用權利要求1所述的真核細胞表達載體和權利要求10所述的篩選方法獲得的穩定表達CHO細胞株。

15.權利要求14中所述的蛋白是受體蛋白，細胞因子，抗體，激酶或其他功能蛋白。

16.權利要求14所述的蛋白表達方法使IFNγR1受體Fc融合蛋白的表達水平大于100mg/L，單位細胞表達水平(Qp)達到50～60皮克/細胞/天。

17.權利要求16所述的蛋白表達水平是細胞在含血清貼壁條件下培養獲得的。