[發(fā)明專利]一種整合牛NRAMP1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體/牛成纖維細(xì)胞及其方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010603533.0
• 申請(qǐng)日: 2010-12-17
• 公開（公告）號(hào): CN102559749A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王華巖;程祥;鄧捷;馬曉玲;孟書燕;來威鋒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N5/10;C12N15/06
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• 代理人: 暫無信息

1.一種整合牛NRAMP1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于：其包含巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子SP以及HA標(biāo)簽的目的基因NRAMP1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述整合牛NRAMP1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于：還包括抗性篩選基因neo基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述整合牛NRAMP1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于：該載體通過用SacII和BamHI酶切將NRAMP1基因克隆到巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP載體上，然后用BamHI和NotI將EGFP切除掉而獲得。

4.一種含有權(quán)利要求1所述載體的牛成纖維細(xì)胞，其特征在于：其宿主細(xì)胞是秦川牛耳朵皮膚成纖維細(xì)胞，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將目的基因NRAMP1整合到牛成纖維細(xì)胞的基因組中。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述牛成纖維細(xì)胞，其特征在于：所述的宿主細(xì)胞是5-8代的秦川牛耳朵皮膚成纖維細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述牛成纖維細(xì)胞，其特征在于：該牛成纖維細(xì)胞作為核移植共體細(xì)胞構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚。

7.一種整合牛NRAMP1巨噬細(xì)胞特異性載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法包括：

1)牛NRAMP1基因克隆

1.1)在牛NRAMP1基因的開放閱讀框首尾兩端設(shè)計(jì)分別含有SacII和BamHI酶切位點(diǎn)的引物，

正向引物1F：5’-CCGCGGGTCGCCACCATGTCAGGTGACACGGGC-3’；

反向引物1R：

5’-GGATCCCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATCCCGAGGTCCTCCCCTTCTC-3’：

1.2)取成體秦川黃牛脾臟中約10mg組織，采用Trizol方法提取脾臟組織中的總RNA，利用cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA；

1.3)以cDNA為模板，用引物對(duì)1F和1R，用Triplemsaster?system?PCR擴(kuò)增牛NRAMP1基因；反應(yīng)條件是95℃，5min；95℃30sec；66℃30sec；72℃2min；36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；

1.4)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，與pGEM-T?Easy載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑選重組子，對(duì)EcoRI酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序正確的陽性克隆命名為pGEM-T-easy-NRAMP1并用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析；

2)牛NRAMP1巨噬細(xì)胞特異性載體構(gòu)建

2.1)巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP

巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP可以在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，其中包含巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子SP；

以pSP-EGFP載體為骨架，通過插入目的基因NRAMP1并去掉EGFP構(gòu)建NRAMP1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-NRAMP1-HA；

2.2)含NRAMP1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-NRAMP1-HA的構(gòu)建

將pGEM-T-easy-NRAMP1，pSP-EGFP分別用SacII和BamHI雙酶切，回收NRAMP1基因片段和載體，用T4DNA連接酶連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α，用PstI酶切篩選陽性克隆；得表達(dá)載體pSP-NRAMP1-EGFP；

將pSP-NRAMP1-EGFP用BamHI和NotI雙酶切并用Klenow補(bǔ)平，膠回收除去EGFP的載體并用T4DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α，用XhoI和HpaI雙酶切篩選陽性克隆，得pSP-NRAMP1-HA載體；

2.3)pSP-NRAMP1-HA載體的驗(yàn)證

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7用含有10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃的CO₂孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。將巨噬細(xì)胞接種于24孔板，24h后更換無血清的DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)準(zhǔn)備用脂質(zhì)體-2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSP-NRAMP1-HA，轉(zhuǎn)染48h后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，4％多聚甲醛固定10min；用10％山羊血清封閉15min，0.2％Triton?X-100處理2min后用鼠源HA單抗4℃孵育過夜；用TRITC標(biāo)記的抗鼠的二抗室溫孵育1h，PBS洗5min×2次，用Hochest33342染核1min，然后用熒光顯微鏡觀察NRAMP1的表達(dá)。