[發明專利]一種纖維堆囊菌高密度發酵與埃博霉素產物分離偶聯的生產工藝

無效

• 申請號: 201010603114.7
• 申請日: 2010-12-24
• 公開（公告）號: CN102174426A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 劉新利;趙林;陸震;高海燕;顧文雪;李亞偉
• 申請（專利權）人: 山東輕工業學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/18;C07D493/04;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種纖維堆囊菌高密度發酵與埃博霉素產物分離偶聯的生產工藝，屬于發酵工程技術領域。

背景技術

1993年，德國國家生物技術中心(GBF)的G.等人報道了他們從粘細菌的纖維堆囊菌So.ce?90菌株的發酵液中，分離出來具有抑制真菌活性和細胞毒活性的Epothilone?A和B(圖1)。1995年，默克研究院的D.M.Bollag等在大規模篩選微管抑制劑時發現一株纖維堆囊菌SMP?44的發酵提取物具有抑制微管蛋白解聚、破壞有絲分裂的活性，經分析鑒定該活性組份為Epothilone?A和B，它與紫杉醇具有相同的抑制腫瘤細胞生長的作用機制，并且比紫杉醇具有更多優點。2007有一種埃博霉素類B的衍生物伊沙皮龍經美國FDA批準上市，目前有六種埃博霉素類化合物進入了臨床研究，埃博霉素類化合物在當今抗癌藥物領域異軍突起，該類化合物的大規模生產技術研究迫在眉睫。

但是，埃博霉素的產生菌纖維堆囊菌的代時長，生長緩慢，營養攝取率很低，氧的消耗比較少，發酵周期長，發酵時細胞濃度較低，野生型菌株發酵液中每毫升細胞數不大于10⁹個。國內外對纖維堆囊菌發酵生產埃博霉素的研究較少。Gerth等1996年報道So?ce90菌株發酵產生埃博霉素的檢測產量為22mg/L，埃博霉素A和B的比例大約為2∶1。Gerth等還通過同位素標記的底物方法，闡述了埃博霉素的碳骨架的組成，并研究了幾種主要天然埃博霉素之間的關系，為埃博霉素發酵過程中前體物質的添加，以及進一步闡明原始菌株中埃博霉素的代謝途徑打下了基礎。國內僅有零星幾個專利報道過纖維堆囊菌發酵產生埃博霉素的技術(ZL02110068.3、ZL02110067.5、ZL200510100338.5)，但沒有針對纖維堆囊菌高密度發酵和埃博霉素產物分離偶聯生產工藝的報道。

發明內容

本發明針對當前纖維堆囊菌發酵生產埃博霉素工藝中的不足，公開了一種纖維堆囊菌高密度發酵與埃博霉素產物分離偶聯的生產工藝。

本發明的技術方案如下：

通過流加碳氮源物質和前體物質實現纖維堆囊菌的高密度發酵，使用可以多次循環利用的吸附樹脂，實現埃博霉素產物分離，并將高密度發酵與產物分離偶聯，解除終產物埃博霉素對纖維堆囊菌的反饋抑制，提高埃博霉素的產量。

具體工藝步驟為：

1.纖維堆囊菌菌種制備：埃博霉素生產菌株纖維堆囊菌So0157-2，由山東大學微生物技術國家重點實驗室李越中教授提供，保藏于中國典型微生物保藏中心，編號CCTCC?NO.M208078。菌種使用前經固態活化培養基在28-32℃培養5-7天活化，經液態種子培養基在30-32℃培養3-5天，當細胞量達到10¹⁰時接種發酵培養基，發酵罐裝液系數70％，接種量為5-10％(V/V)，發酵周期7-9天。

如1所述的固態活化培養基為：土豆淀粉0.1-3％，大豆蛋白胨0.1-2％，葡萄糖0.1-2％，酵母膏0.2-1％，MgSO₄0.1-1％，CaCL₂0.1-1％；TE?1.0-2.0ml/L；pH7.0-8.0。加0.5-1.5％瓊脂，121℃滅菌20min使用。

如1所述的液態種子培養基為：土豆淀粉0.1-3％，大豆蛋白胨0.1-2％，葡萄糖0.1-2％，酵母膏0.2-1％，MgSO₄0.1-1％，CaCL₂0.1-1％；TE?1.0-2.0ml/L；pH7.0-8.0。121℃滅菌20min使用。

如1所述的發酵培養基為：馬鈴薯淀粉0.1-4％、葡萄糖0.1-3％、蛋白胨0.1-2％、豆餅粉0.1-2％和脫脂奶粉0.1-2％，Na₂HPO₄0.01-1％、K₂HPO₄0.01-1％、MgSO₄0.1-1％、CaCl₂0.1-1％、FeCl₃-EDTA0.001-0.01％，pH調整7.0-9.0。121℃滅菌20min使用。

2.流加補料發酵：從發酵開始后的第30-70h補加濃度為2g/L的葡萄糖，每小時流加原始發酵液體積的0.01-0.1％。從發酵過程中的第70-120h添加前體營養物質混合液。該混合液放入發酵罐補料瓶內，滅菌后采用蠕動泵自動流加，每小時流加原始發酵液體積的0.01-0.05％。